17-AAG聯合吉西他濱對人胰腺癌BxPC-3細胞株增殖的影響

戴樹龍 馬海青 李斐 楊坤興

吉西他濱(gemcitabine, GEM)單藥化療為晚期胰腺癌的標準一線治療，但療效欠佳，耐藥是導致化療失敗的主要原因[1]。HSP90是一種分子伴侶蛋白，參與蛋白質的聚集、折疊、裝配及轉運等過程，與胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等多種惡性腫瘤的發展都有密切的關系[2]。17-AAG是HSP90的特異性抑制劑，對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，成為治療的新靶點。本研究采用CCK-8法測定不同時間、不同濃度的17-AAG、GEM及兩者聯合用藥對人胰腺癌BxPC-3細胞株增殖的抑制作用，為中晚期胰腺癌患者提供新的聯合化療方案和理論依據。

一、材料與方法

1．細胞培養及分組： 人胰腺癌細胞株BxPC-3購自南京凱基生物公司，常規培養傳代。取對數生長期細胞，以3×104個/ml的密度接種于96孔板，每孔200 μl，分為空白組、對照組、17-AAG組、GEM組、聯合用藥組。空白組只加培養液；對照組為不加藥的BxPC-3；17-AAG組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml 17-AAG的各組；GEM組分為終濃度10.0、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml GEM的各組；聯合用藥組按照單藥組的濃度梯度聯合應用17-AAG和GEM。每組設5個復孔。17-AAG購自美國SANTA公司，GEM由南京市第一醫院腫瘤科提供。

2．CCK-8法檢測細胞增殖抑制率： 上述各組細胞分別培養24、48 h后每孔加入5 mg/ml CCK-8液20 μg，繼續培養4 h。上酶標儀測定各孔在波長490 nm處的吸光值(A490值)，以空白組調零。細胞增殖抑制率=(對照組A490值-實驗組A490值)/ 對照組A490值×100%。實驗重復3次，取均值。

二、結果

17-AAG組、GEM組及聯合用藥組均呈濃度及時間依賴性抑制BxPC-3細胞的增殖。與對照組相比，不同濃度的17-AAG、GEM對BxPC-3細胞作用24 、48 h后均有抑制作用(圖1、2)；隨著藥物濃度的增加，其產生的抑制效果越明顯(P<0.05)。作用48 h各組對BxPC-3細胞增殖的抑制率高于24 h各組；聯合用藥組24、48 h時對BxPC-3細胞增殖的最高抑制率分別為65.1%及83.2%，顯著高于單獨用藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。

討論胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，85%的患者就診時已屬晚期，手術切除率僅10%～15%，5年生存率僅1%～5%[3]。GEM常用于中晚期胰腺癌的化療，但易產生耐藥。Derong等[4]研究表明，細胞外信號調節激酶(ERK)參與調節多重耐藥基因(MDR-1)和核糖核苷還原酶(RRM1)的表達改變可能與胰腺癌對GEM的抵抗有關。

圖1 24 h時各實驗組藥物對人胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率

圖2 48 h時各實驗組藥物對人胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率

HSP90在多種腫瘤組織中呈高表達狀態。李亮等[5]發現胰腺癌組織中HSP90的表達不僅明顯高于正常組織，且其表達還與淋巴轉移及臨床分期相關。17-AAG是HSP90的特異性拮抗劑，目前已進入了臨床應用，在實體腫瘤及白血病的臨床治療中均有不錯的效果[6]。一方面，17-AAG通過增加抑癌基因p53的表達從而發揮抗腫瘤作用[7]；另一方面，17-AAG可減輕肺癌患者對放療藥的耐藥性，明顯增強其治療效果[8]。因此，17-AAG可能還可以通過調節ERK通路增強胰腺癌患者對GEM的敏感性。

本研究通過CCK-8法證實聯合應用17-AAG與GEM對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的抑制率明顯高于單獨用藥組，在48 h時最高可達83.2%。但目前的結果僅限于細胞水平的研究，本課題組還將進一步建立胰腺癌裸鼠動物模型來評估聯合用藥在體內實驗中的效果及安全性，并測定與腫瘤相關的HSP90伴侶蛋白胰島素樣生長因子、表皮生長因子受體、磷脂酰激酶-3-激酶及酪氨酸激酶的表達，進一步探討17-AAG和GEM聯合用藥的抗癌機制，為胰腺癌聯合化療的可行性提供新的實驗室依據。

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[2] Pandey P, Saleh A, Nakazawa A, et al. Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90[J].EMBO J,2000,19(16):4310-4322. DOI:10.1093/emboj/19.16.4310.

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