山東省攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的分子流行病學(xué)研究

李宜雷,趙 輝，賈 楠，董丹丹，劉真真，朱元祺，*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003)

碳青霉烯類(lèi)抗生素被認(rèn)為是目前臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的最后一道防線。近年來(lái)隨著這類(lèi)抗生素的廣泛使用，碳青霉烯類(lèi)耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的分離率也呈上升趨勢(shì)[1,2]。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1型(NDM-1)是一種常見(jiàn)的碳青霉烯酶，是Ambler分類(lèi)中B類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶[3]。研究發(fā)現(xiàn)，近幾年不斷檢出該基因的不同亞型。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-5型(NDM-5)是Hornsey[4]于2011 年報(bào)道的新亞型。隨后，陸續(xù)有在不同的國(guó)家和地區(qū)檢出產(chǎn)NDM-5腸桿菌的報(bào)道，且報(bào)道逐年增加。同NDM-1一樣，此類(lèi)酶水解除氨曲南外的幾乎所有β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，常常也攜帶其他耐藥基因，表現(xiàn)對(duì)喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)等臨床常用抗生素耐藥，但Hornsey等[4]試驗(yàn)還表明NDM-5酶的水解活性要高于NDM-1酶。因此，對(duì)攜帶blaNDM-5基因的腸桿菌進(jìn)行研究，有助于針對(duì)性制定醫(yī)院感染預(yù)防和控制指南。為此，我們收集了山東省3家醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室2015年3月-2016年12月間分離的20株對(duì)亞胺培南耐藥的大腸埃希菌，篩選其攜帶的blaNDM-5基因，然后對(duì)這些NDM-5陽(yáng)性菌株的耐藥表型和耐藥基因型及其同源性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集濟(jì)南、濟(jì)寧和青島市3家醫(yī)院于2015年 3月-2016年12月臨床分離的對(duì)亞胺培南耐藥的大腸埃希菌20株。這些菌株重新用法國(guó)梅里埃公司Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌的鑒定和藥敏。藥物敏感性判定依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所2016 年 CLSI M100S-26標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。儀器的質(zhì)控菌株為ATCC27853、ATCC25922、ATCC700323、ATCC700324、ATCC35218和ATCC700603，為本實(shí)驗(yàn)室保存。沙門(mén)氏菌H9812 菌株(脈沖場(chǎng)凝膠電泳Marker)由青島市疾病控制中心惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴(kuò)增儀、脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(CHEF-DR Ⅲ)和全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad 公司。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、DL2000maker、S1和 Xba I核酸酶購(gòu)自大連寶生生物(Takara公司)。

1.3 耐藥基因分析

熱裂解法提取菌株DNA，首先PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序確定菌株攜帶的blaNDM-5基因，然后，再對(duì)陽(yáng)性菌擴(kuò)增其他碳青霉烯酶耐藥基因(KPC、IMP、VIM、OXA-48、BIC、SPM、AIM、GIM、SIM和SIM)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM、SHV、CTX-M和OXA-1)、氨基糖苷和喹諾酮類(lèi)耐藥基因[acc(6')Ib，qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS]。引物序列及 PCR 擴(kuò)增參數(shù)參照文獻(xiàn)[5,6]。各引物合成和PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物(上海)工程股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定耐藥基因型。

1.4 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

按照大腸埃希菌MLST 網(wǎng)站提供的7個(gè)管家基因的引物(adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA)序列進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果在該網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)得出菌株的序列分型(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/ecoli/allele_st_search)。

1.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)

對(duì)產(chǎn)NDM-5的大腸埃希菌進(jìn)行PFGE分析，操作步驟和結(jié)果判讀參照Tenover相關(guān)文獻(xiàn)[5,7]。沙門(mén)菌H9812菌株和臨床菌株用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI一樣處理，并作為Marker。電泳參數(shù)：溫度14℃、分子量30 kb-700 kb、場(chǎng)強(qiáng)6 V/cm、轉(zhuǎn)角120°、轉(zhuǎn)換時(shí)間2.16-63.8 s、電泳時(shí)間18 h。

2 結(jié)果

2.1 攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的藥敏結(jié)果

用法國(guó)梅里埃公司Vitek-2 Compact對(duì)收集分純后的20株大腸埃希菌重新進(jìn)行細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)，并PCR擴(kuò)增和測(cè)序確定菌株是否攜帶NDM-5基因。經(jīng)檢測(cè)，其中11株大腸埃希菌攜帶blaNDM-5基因，且這11株菌對(duì)包括碳青霉烯酶類(lèi)在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥率最高，除對(duì)氨曲南耐藥率82%外，均高達(dá)100%耐藥率。對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率也比較高，分別為54%、73%、73%和64%。僅有1株對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感，其余10株均呈現(xiàn)耐藥。但是，所有11株菌對(duì)呋喃妥因未出現(xiàn)耐藥(敏感率36%，中介率64%)。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

2.2 菌株耐藥基因檢測(cè)和多位點(diǎn)序列分型結(jié)果

除了經(jīng)擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)確認(rèn)11株菌攜帶blaNDM-5基因外，且每一株菌還攜帶多個(gè)其他耐藥基因，如CTX-M-55、OXA-1、TEM-1和acc(6')Ib等耐藥基因。11株菌中，6株分離自尿液，痰液和膿液各2株，血液1株。多位點(diǎn)序列分型顯示這11株大腸埃希菌共分為7個(gè)ST型，以ST167為主，共4株(36.4%，4/11)， 其他分別為ST617型2株(18.2%，2/11)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。詳見(jiàn)圖1和表2。

2.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE結(jié)果

脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)與沙門(mén)菌H9812菌株比對(duì)，這11株大腸埃希菌的脈沖電泳條帶數(shù)目、位置均不相互一致，依據(jù)Tenover規(guī)則判定，都屬于暴發(fā)不相關(guān)(Unrelated)菌株，即山東省三個(gè)醫(yī)院雖然都存在攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌的流行，但在醫(yī)院內(nèi)或三個(gè)醫(yī)院間沒(méi)有呈現(xiàn)菌株的克隆聚集性，都屬于散發(fā)克隆。詳見(jiàn)圖2。

表1 11株攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌臨床株的藥敏結(jié)果(μg/mL)

表2 11株產(chǎn)NDM-5大腸埃希菌攜帶的耐藥基因和多位點(diǎn)序列分型

M：DL2000 marker；Lane1：NDM-5；Lane2：CTX-M；Lane3：TEM-1；Lane4：OXA-1 ；Lane5：陰性對(duì)照

圖1耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

自新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1型(New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1)2009年在印度首次報(bào)道[3]以來(lái)，攜帶該基因的細(xì)菌已被發(fā)現(xiàn)在全球范圍流行并引發(fā)多種類(lèi)型感染[1,8]。攜帶blaNDM 菌由于編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因點(diǎn)突變，已報(bào)道有多個(gè)亞型，其中以NDM-1亞型最多見(jiàn)[8]。許多變異亞型(如NDM-2 和NDM-3)與NDM-1 具有相似的水解活性，原因在于酶活性中心部位沒(méi)有發(fā)生突變。blaNDM-5首次報(bào)道于1株ST648型大腸埃希菌，是 NDM 型碳青霉烯酶的另一種亞型，與 NDM-1只有 2個(gè)氨基酸的差別(Val88Leu，Met154Leu)，但比NDM-1具有更高的酶活性[4]。隨后，在英國(guó)、印度、阿爾及利亞、日本和中國(guó)也有被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道[9-13]。

M：沙門(mén)菌H9812；Lane1-11：1-11號(hào)攜帶blaNDM-5基因大腸埃希菌

11株菌藥敏試驗(yàn)顯示，除氨曲南外，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥，同時(shí)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素(阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、喹諾酮類(lèi)抗生素(左氧氟沙星和環(huán)丙沙星)部分敏感。氨曲南的化學(xué)結(jié)構(gòu)與金屬β-內(nèi)酰胺活性位點(diǎn)(MBL)沒(méi)有足夠的分子交互作用，因而有兩株blaNDM-5大腸埃希菌對(duì)氨曲南沒(méi)有發(fā)生水解，但其他9株NDM-5大腸埃希菌由于攜帶其他β-內(nèi)酰胺酶等耐藥基因，因而氨曲南顯示耐藥。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶有作用，氨曲南和阿維巴坦混合物可能是治療產(chǎn)NDM耐藥菌感染的最佳方案，尤其是當(dāng)其他β-內(nèi)酰胺酶存在時(shí)[14]。

11株菌除了攜帶blaNDM-5基因外，還攜帶多個(gè)其他耐藥基因。本試驗(yàn)菌株82%攜帶CTX-M，55%攜帶acc(6’)Ib和TEM-1，27%攜帶OXA-1，呈現(xiàn)多重耐藥表型和基因型，這給臨床治療帶來(lái)了困難。MLST的結(jié)果表明11株大腸埃希菌屬于7種不同的ST分型，以ST167型為主，共4株，占36.4%， 其他分別為ST617型2株(18.2%)，ST46、ST453、ST448、ST6388和ST410型各1株。經(jīng)檢索，除了ST167和ST448型外[13,15]，攜帶blaNDM-5基因的ST617、ST46、ST453、ST6388和ST410型大腸埃希菌為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。目前，國(guó)內(nèi)外尚未有NDM-5菌株引起暴發(fā)流行的報(bào)道。與之相符的是，我們的PFGE結(jié)果同樣呈現(xiàn)出不同的脈沖帶型，即來(lái)自山東省三家醫(yī)院菌株的同源性差異較大，均為散發(fā)病例。雖然，這些菌株未發(fā)現(xiàn)流行病學(xué)上的聯(lián)系，但鑒于攜帶blaNDM-5細(xì)菌的高水平耐藥，應(yīng)引起足夠的重視。

綜上所述，山東省三家醫(yī)院都檢測(cè)到攜帶blaNDM-5基因的大腸埃希菌，以ST167型為主，沒(méi)有呈現(xiàn)克隆聚集性，屬于散發(fā)病例。但是，山東省存在未見(jiàn)報(bào)道的多位點(diǎn)序列分型的攜帶blaNDM-5基因的大腸埃希菌的流行。因此，公共衛(wèi)生部門(mén)和醫(yī)院應(yīng)做好耐藥監(jiān)測(cè)和醫(yī)院感染預(yù)防和控制工作，防止克隆傳播引起的醫(yī)院感染暴發(fā)。

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