近紅外拉曼光譜分析用于胃腸道間質瘤診斷的研究

蘇新喆，趙吉生，高永建，丁大勇

(吉林大學中日聯誼醫院 胃腸結直腸肛門外科,吉林 長春130033)

胃腸間質瘤(GIST)，是起源于消化道的最常見的軟組織肉瘤。病理診斷，尤其是免疫組織化學檢測是確診GIST的唯一手段。因為GIST質脆，活檢過程中容易導致腫瘤出血和播散，因此GIST在術前診斷存在困難[1]。建立一種實時、無損、準確、客觀的胃腸道間質瘤術前診斷方法具有極其重要的意義。近紅外線激光拉曼光譜技術是一種以物質特定的分子振動光譜來識別不同的物質結構的無損檢測技術。近年來，拉曼光譜技術成為研究生物物質分子結構的有效手段。本文采用近紅外拉曼光譜檢測、免疫組化等方法檢測胃腸道間質瘤組織，對拉曼光譜檢測在胃腸道間質瘤診斷的應用進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

收集到中日聯誼醫院胃腸外科2011年-2015年胃腸道間質瘤術后腫瘤腫物及正常腸組織(距離病灶邊緣2 cm以上)52份，其中胃間質瘤組織40份，小腸間質瘤組織10份，直腸間質瘤組織2份。組織樣本離體后用生理鹽水清洗3遍，每一份組織樣品均分成兩份，每份大小約0.5 cm3，一份放入10%福爾馬林溶液固定，然后行常規石蠟包埋，制備成10 μm厚的連續切片，并行常規HE染色及免疫組織化學染色，病理證實；另一份放入凍存管中，放入液氮罐中保存。本研究納入的患者未行術前靶向治療，標本收集經患者及家屬術前知情同意。

兔抗人CD117、DOG1單克隆抗體購自Life Science INC；辣根過氧化物酶偶聯二抗購自Amersham Pharmacia。實驗儀器激光共焦顯微鏡InVia+Plus型顯微拉曼光譜儀(英國Renishaw 公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學染色 標本置入10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋。石蠟標本10 μm厚連續切片,置56℃烤箱中干烤2小時，冷卻后切片脫蠟，水化后用PBS沖洗。將組織切片放入裝有0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)的盒子中，微波爐中加熱至沸騰，維持5分鐘，自然冷卻。每張切片加1滴過氧化酶阻斷液，對內源性過氧化物酶進行滅活。滅活后用PBS沖洗。除去PBS液，每張切片加5%小牛血清，室溫下孵育5分鐘。除去血清，每張切片加1滴一抗(CD117抗體濃度1∶1 500，DOG1抗體濃度1∶1 000)，4度冰箱內孵育過夜。PBS沖洗后切片加二抗(1∶1 000)，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗。除去PBS液，DAB顯色。

1.2.2拉曼光譜分析 將裝有組織樣品的凍存管從液氮罐中取出，置于室溫下解凍半小時，再用無菌鑷將樣品從凍存管中取出，表面處理平整后置于載玻片上，把載玻片連同組織樣本放在樣本臺上。調節兩個開關使自然光照到樣品上；調節控制器移動樣品臺；調節焦點位置，使焦點聚集到組織樣品上；調節允許激光通過，屏蔽白光，按預定設置的參數獲取不同波數下的拉曼光譜，重復采集。光譜圖輸入計算機，再運用Origin8.5軟件進行數據和圖譜處理。

1.2.3統計方法 計數資料采用χ2檢驗，用SPSS20.0統計分析軟件進行數據分析和統計學處理。繪圖采用Origin8.5繪圖軟件。

2 結果

2.1 胃腸道間質瘤組織免疫組織化學染色結果分析

將PBS 作為陰性對照,CD117和DOG1蛋白陽性表達率分別為96.1%(50/52)，94.2%(49/52)。DOG1、CD117 陽性染色主要定位在細胞膜和細胞質(圖1)。CD117和DOG1蛋白表達與胃腸道間質瘤危險度分級無統計學差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 拉曼光譜分析結果

2.2.1胃腸道間質瘤和正常對照組織的拉曼光譜比較 為明確胃腸道間質瘤和正常對照組織的拉曼光譜是否有明顯差異，我們對44例胃腸道間質瘤組織標本和正常對照進行了拉曼光譜檢測。結果顯示胃腸道間質瘤組織在1 656 cm-1、1 452 cm-1處出現兩個拉曼峰，而正常對照組織在1 452 cm-1不存在拉曼峰(圖2)。說明拉曼位移1 452 cm-1是胃腸間質瘤組織的特征性拉曼峰。

圖1 胃腸道間質瘤組織的HE染色和免疫組織化學染色

CD117(+)DOG1(+)NIH分級低風險16/1615/16中風險5/55/5高風險29/3129/31

2.2.2分析組織拉曼光譜檢測結果與危險度分級之間的關系 為明確胃腸道間質瘤組織的拉曼光譜是否與危險度分級有關，我們對胃腸道間質瘤低度惡性潛能組織標本和高度惡性潛能標本各15例進行了拉曼光譜檢測。結果顯示兩組之間1 656 cm-1、1 452 cm-1處出現兩個拉曼峰，兩組在1 452 cm-1峰強之間有顯著差異(圖3、圖4)。

3 討論

人體細胞每一種生物大分子都有其對應的拉曼峰。蛋白質、DNA、脂類的部分原子團結構和鍵的位置對特定的振動頻率敏感，生物分子的拉曼光譜中含有特定的的結構和成分信息[2]。腫瘤組織的生物大分子的結構和成分與正常組織相比發生了顯著的變化，因此腫瘤組織的拉曼光譜有較高的特異性。同時，拉曼光譜在腫瘤血液標志物的檢測及早期診斷方面也具有獨特優勢[3]。由于水的拉曼光譜非常弱，拉曼光譜可以在活體狀態下來研究人體大分子的結構及其變化。已有研究表明在內鏡下使用拉曼光譜對活體腫瘤進行早期原位檢測具有較強的敏感性和特異性[4]。

圖2 腸間質瘤和正常對照組織的拉曼光譜比較

圖3 胃腸間質瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜比較

圖4胃腸間質瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜峰強比較

間質瘤組織和良性組織相比，具有細胞密度增高，細胞呈單一化。本研究結果顯示胃腸間質瘤組織和正常對照組織的拉曼光譜存在明顯差異，腫瘤組織特征性拉曼光譜位于1 452 cm-1波數處，這說明間質瘤組織與正常組織的明顯差異。這樣的結果需要進一步在活體中證實。

NCCN指南及中國胃腸道間質瘤專家共識中GIST根據部位、大小及核分裂像進行危險度分級，來評估其惡性潛能。但是該分級方式在術前難以做到，無法對手術方式的進行指導。因此建立一種無創的胃腸道間質瘤術前進行危險度分級的技術手段是非常必要的[1]。本文研究表明CD117和DOG1蛋白表達與胃腸道間質瘤危險度分級無統計學差異，而胃腸道間質瘤低度惡性潛能組織和高度惡性潛能組織的拉曼光譜在1 452 cm-1波數處峰強存在顯著性差異。胃腸道間質瘤惡性潛能除了和大小及部位有關外，最主要與細胞核分裂像的多少有關。惡性潛能高的腫瘤細胞核核分裂像增多，有絲分裂活躍，而拉曼光譜的峰值與細胞的組成成分直接相關，所以惡性潛能不同的胃腸道間質瘤組織的拉曼光譜是存在異常的。

參考文獻：

[1]Li J,Ye Y,Wang J,et al.Chinese consensus guidelines for diagnosis and management of gastrointestinal stromal tumor[J].Chin J Cancer Res,2017,29(4):281.

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