人參皂苷Rg5通過下調Bcl-2蛋白促進食管癌Eca-109細胞凋亡

張道明,張 奇,劉林林,任 輝

(吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的致死率，每年導致超過40萬人死亡,是消化系統(tǒng)中僅次于胰腺癌的難治性惡性腫瘤[1]。目前的主要治療方法包括手術治療，放療，化療和靶向治療。手術切除仍是其主要治療方法，但5年總生存率僅為30%左右，其中約20%-50%歸因于鱗狀細胞癌[2]。傳統(tǒng)的化療藥物對于食管癌的治療作用不理想，近幾十年隨著順鉑和氟尿嘧啶類衍生物、奈達鉑、希羅達、伊立替康等新藥的應用，為食管癌的化療提供了更多的可選擇方案，在臨床應用中起到了一定積極作用。

近年來中藥在惡性腫瘤防治方面的價值得到認可。有學者根據不同癥型配置個體的中藥湯劑應用于患者的輔助治療中，起到了增加療效、減輕副作用、改善生存質量等作用[3,4]。目前已經上市的中藥有參一膠囊、康萊特注射液、消癌平、鴉膽子油等，在臨床應用中也取得了可喜的療效。人參皂苷Rg5是從人參中分離出來的新型人參皂苷，在腫瘤治療中具有巨大潛力。本研究通過體外實驗觀察其對于食管癌細胞的影響并研究相關機制。

1 材料與方法

1.1細胞和藥物選取食管癌高分化鱗狀細胞Eca-109進行實驗。人參皂苷Rg5購至上海源葉生物科技有限公司，分子式為C42H70O12，經純度驗證為99.3%。

1.2主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購于Hyclone 公司，胎牛血清購至NQBB公司。CCK8 試劑盒來自日本同仁化學研究所，Annexin V/FITC凋亡試劑盒購于康潤生物試劑有限公司。彩色預染蛋白質marker和RIPA裂解液使用全式金生物試劑有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購至索萊寶生物科技有限公司產品。兔抗人C-caspase 3，9、C-parp多克隆抗體以及Bax、Bcl-2多克隆抗體來自美國Cell Signaling Technology公司。酶標抗兔二抗來自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)在100 mm的培養(yǎng)皿中用含有1%的青霉素鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行細胞的培養(yǎng)，在37℃含5%二氧化碳的恒溫箱中培育。傳代時首先棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次，加入2 ml 0.25%的胰酶，在37℃恒溫箱中消化3-5分鐘，待可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙時棄去胰酶，加入4 ml培養(yǎng)基，用槍頭吹打重懸細胞。收集細胞于離心管中，離心后棄去上清，重新加入6 ml培養(yǎng)基，按照1∶2—1∶4 比例傳代于新培養(yǎng)皿中。

1.4CCK8檢測細胞抑制率將Eca-109細胞重懸后將濃度調節(jié)至4×104/ml，以每孔100 μl的量接種于96孔板中，恒溫孵育箱中孵育24小時。設置人參皂苷Rg5藥物濃度為：16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L、0.5 μmol/L；每個濃度設置5個副孔并且設置不加藥物的對照組和不含細胞的空白組。恒溫孵育24小時后在每孔加入10 μl CCK8試劑，孵育2-4小時。之后在酶標儀上450 nm處讀取吸光度OD值。細胞抑制率計算公式：細胞抑制率=(對照組OD-加藥組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。并利用SPSS軟件計算人參皂苷Rg5的半數抑制濃度(IC50)。

1.5AnnexinV/FITC雙染檢測細胞凋亡設置以下分組：對照組(不加藥)、低濃度組(5 μmol/L Rg5)、中濃度組(10 μmol/L Rg5)和高濃度組(20 μmol/L Rg5)。藥物作用24小時后收集細胞，用已稀釋的1×緩沖液將細胞濃度調節(jié)大約(1-5)×106/ml，并取100 μl置入流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC充分混合，避光孵育5分鐘之后加入10 μl 20 μg/ml的PI和400 μl的PBS，立刻通過流式細胞儀進行檢測。

1.6Westernblot法檢測蛋白變化按照同上分組處理細胞，24小時后收集細胞，進行總蛋白提取并使用BCA法確定蛋白濃度進行定量。進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后通過濕轉的方法將蛋白轉移至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉2小時。加入C-caspase3、C-caspase9、C-parp、Bcl-2、Bax對應的稀釋多克隆抗體，4℃過夜孵育。洗膜后加入二抗搖床孵育1小時。再次洗膜后通過顯色儀器進行ECL顯影。Imagine J軟件測量條帶灰度值，并以目的蛋白和β-actin積分光密度比值作為蛋白相對量進行比較。

1.7統(tǒng)計分析數據用平均值±標準偏差進行表示。 統(tǒng)計處理使用SPSS 22.0軟件。單因素方差分析比較組間差異，兩組比較運用t檢驗。檢驗結果P<0.05即有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1人參皂苷Rg5抑制Eca-109細胞增殖結果得出人參皂苷Rg5抑制Eca-109細胞增殖，并呈劑量依賴性。通過SPSS軟件計算，人參皂苷Rg5的IC50為8.74 μmol/L，如圖1。

圖1 人參皂苷Rg5對食管癌細胞生長的影響

2.2人參皂苷Rg5促進Eca-109細胞凋亡通過流式細胞儀檢測細胞凋亡得出：空白組細胞凋亡率為(3.87±2.24)%，且Rg5低濃度組為(11.37±3.52)%，中濃度組為(23.68±3.18)%，高濃度組為(32.17±4.54)%，均高于對照組(P<0.05)。可得出人參皂苷Rg5可促進Eca-109細胞凋亡，并與藥物劑量正向相關，如圖2和表1。

表1 各組細胞凋亡率

注：*表示與對照組相比，P<0.05；

2.3人參皂苷Rg5導致caspase家族蛋白變化通過蛋白印跡法分析結果提示處理后細胞中剪切活化的caspase 3、9表達量隨著藥物濃度升高而升高，同時caspase家族的下游效應蛋白C-parp也明顯增多，如圖3。

圖2 各組細胞凋亡流式圖

注：*表示與對照組相比，P<0.05；

2.4人參皂苷Rg5導致細胞Bcl-2蛋白表達下降Western blot法檢測蛋白結果提示，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax沒有明顯變化，抑制凋亡蛋白Bcl-2降低，因此人參皂苷Rg5導致 Bcl-2/Bax比值下降，且統(tǒng)計學有差異(P<0.05)，如圖4。

注：*表示與對照組相比，P<0.05；

3 討論

人參是中國珍貴的中草藥，人參皂苷是其發(fā)揮藥理作用主要的成分。相關研究已經證實人參皂苷通過促進細胞凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。據報道，人參提取物JRS-15可通過線粒體途徑促進宮頸癌細胞的凋亡[5]。人參皂苷Rg3誘導人膠質細胞瘤細胞凋亡作用和MEK信號通路調控有關[6]。本實驗通過體外細胞實驗發(fā)現人參皂苷Rg5對于食管癌細胞有較強的抑制生長的作用，同時對于食管癌細胞有明顯的促凋亡作用。

Bcl-2家族蛋白在調節(jié)細胞生長及凋亡等生物學行為有重要作用，根據功能和結構的不同主要分為促凋亡蛋白Bax、Bad、Bid等和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x等，其中Bcl-2和Bax的相對含量決定著細胞凋亡和生長與否。正常情況下，兩者結合為異源二聚體，Bax抑制細胞凋亡進程。當細胞接受到凋亡信號刺激后，Bax表達量增高，Bcl-2表達量受到抑制，同時Bax聚集到線粒體膜上形成同源二聚體，導致氧化磷酸化破壞、線粒體膜通透性降低和DNA合成障礙等生化行為，同時參與caspase家族生物學活動[7]。到本實驗中，我們將被不同濃度的人參皂苷Rg5處理過的細胞進行蛋白提取并進行Western blot方法檢測蛋白，結果提示人參皂苷Rg5處理后細胞中剪切活化的caspase 9、3和C-parp表達量明顯升高，同時Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax沒有明顯變化而Bcl-2表達量明顯降低。這說明人參皂苷Rg5對于食管癌細胞的促凋亡作用和Bcl-2家族蛋白中抑制凋亡蛋白Bcl-2的下調有關。

綜上所述，人參皂苷Rg5處理食管癌細胞Eca-109后可導致細胞凋亡，并且凋亡相關蛋白C-caspase 9、C-caspase3和C-parp表達升高，進一步證實了凋亡行為的發(fā)生。同時凋亡的發(fā)生和下調抗凋亡蛋白Bcl-2有關。后續(xù)將進行其他類型腫瘤的作用以及相關機理的研究，為人參皂苷Rg5作為新型抗腫瘤藥物的可行性提供更多理論依據。

參考文獻：

[1]李 克，于 萍，朱遠鋒，等.中國南方沿海食管癌高發(fā)區(qū)危險因素研究：吸煙作用[J].腫瘤，2002，22(2)：96.

[2]Zhang SW,Zheng RS,Zuo TT,et al.Mortality and survival analysis of esophageal cancer in China [J].Chin J Oncol,2016,38 (9):709.

[3]宋國平,李雯燕,郭平華,等.自擬滋陰解毒方治療食管癌放射損傷58例[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(3):74.

[4]趙 軍,陳桂珍,蒙家祥,等.艾迪注射液聯合同步放化療治療食管癌[J].現代腫瘤醫(yī)學,2011,19(11):2211.

[5]Sun C,Guo XX,Zhu D,et al.Apoptosis is induced in cancer cells via the mitochondrial pathway by the novel xylocydine-derived compound JRS-15[J].International Journal of Molecular Sciences,2013,14(1):850.

[6]Choi YJ,Lee HJ,Kang DW et al.Ginsenoside Rg3 induces apoptosis in the U87MG human glioblastoma cell line through the MEK signaling pathway and reactive oxygen species[J].Oncology Reports,2013，30(3):1362.

[7]Schafer B,Quispe J,Choudhary V,et al.Mitochondrial outer membrane proteins assist Bid in Bax-mediated lipidic pore formation [J].Mol Biol Cell,2009,20 (8):2276.