口腔頜面部細菌感染體外模型的建立

史慶怡,孔晨飛,王曉峰*, 張天夫*

(吉林大學中日聯誼醫院 1.口腔科;2.科學研究中心，吉林 長春130033)

口腔頜面部感染在早期沒有得到有效的治療，會引發頜面部感染，可并發頜面蜂窩織炎、下頜骨骨髓炎等，甚至導致全身性的感染，嚴重者會威脅生命[1]。急性炎癥涉及多個環節誘導產生的免疫介質網絡,其中以促炎癥因子TNF-α、IL-1 以及IL-6 等前炎癥細胞因子最為重要[2，3]。TNF-α、IL-1 和IL-6被早期應答觸發,通過上調黏附分子和趨化因子的表達而吸引炎癥細胞循環,在宿主防御微生物感染中起重要作用[4]。本次實驗中，我們利用細菌脂多糖(LPS)刺激小鼠結締組織成纖維細胞L929初步模擬了體外口腔頜面部感染模型[5]，應用CCK-8、PCR和ELISA等方法檢測了不同時間點細胞培養基上清中炎癥因子及趨化因子等相關基因的表達變化。并檢測了LPS刺激后小鼠巨噬細胞RAW264.7對感染的應答情況，探討炎癥刺激對于機體及免疫細胞的影響，為口腔頜面部感染后的早期診斷和治療提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠結締組織成纖維細胞L929、小鼠巨噬細胞RAW264.7(吉林大學中日聯誼醫院科學研究中心)。RPMI-1640、IMDM培養液、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶(美國Gibco 公司)；RNA 提取試劑Trizol (美國Invitrogen公司)；premix Taq(Roche公司)；M-MLV 逆轉錄酶、LPS(Sigma公司)；IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養與處理

L929、RAW264.7細胞分別培養于含10 %胎牛血清的IMEM、1640培養液中(含10% 青霉素和鏈霉素)，37 ℃ 5% CO2。2-3天傳代1次。細胞鋪于的6孔板中,待細胞擴增至70 %-80 %時,用PBS 沖洗3 次,加入含有LPS(50 μg/ml)的IMDM(不含胎牛血清和雙抗)的培養液培養,分別培養6、12、24小時。PBS作為對照組。

1.3 CCK-8實驗

細胞以2×103細胞/孔密度接種于96孔板中，復種2孔，37℃ 5% CO2過夜。分別加入20、30、40、50、60 μg/ml LPS，培養6、12、24 h后，加入CCK-8檢測450 nm處OD值。取3孔平均值，進行統計分析。

1.4 定量實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)

采用Trizol試劑提取總RNA，以200-500 ng RNA為cDNA合成標準。反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s。而后進行QPCR定量檢測。利用基因特異引物PCR檢測不同循環RNA研究的描述的表達水平。用2(-DDCT)法計算相關基因的表達。相關引物如下：

GAPDH,上游引物序列：5’-GTCGTACCACACGGCATTGTATGG-3’,下游引物序列：5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’,

TNF,上游引物序列：5’-GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’,下游引物序列：5’-GAATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGC-3’,

IL-1,上游引物序列5’-ACGAAGACTACAGTTCTGCCATTGAC -3’,下游引物序列：5’-AGCCTCATCGTCTCATTGCTTGTC -3’,

IL-6,上游引物序列：5’-AGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG -3’,下游引物序列：5’-CATGTGTAATTAAGCCTCCGACTTGTG -3’,

IL-8,上游引物序列：5’-GCTGCTCAAGGCTGGTCCATG-3’,下游引物序列：5’-TGTTCCTGAATACACAGACATCGTAGC-3’,

IL-10，上游引物序列：5’-CTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3’,下游引物序列：5’-GAGTCGGTTAGCAGTATGTTGTCCAG-3’,

IL-23,上游引物序列：5’-GCACCTGCTTGACTCTGACATCTTC-3’,下游引物序列：5’-TGGCTGGAGGAGTTGGCTGAG-3’,

IL-33,上游引物序列：5’-AGACCAGGTGCTACTACGCTACTATG-3’,下游引物序列：5’-ACTCATGTTCACCATCAGCTTCTTCC-3’,

CXCL2,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-GCGTCACACTCAAGCTCTGGATG-3’,

CXCL10,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-CCGGATTCAGACATCTCTGCTCATC-3’,

GDF15,上游引物序列：5’-GAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAG-3’,下游引物序列：5’-TCGGCGTCAGCAGGAGCAG-3’,

FOXO3,上游引物序列：5’-CCGTGAGCAAGCCGTGTACTG-3’,下游引物序列：5’-TATCCAGCAGGTCGTCCATGAGG-3’。

1.5 ELISA法測定細胞因子水平

細胞以5×105細胞/孔密度接種于24孔板中，分別培養6 h、12 h、24 h、48 h，每孔加入50 μg/ml LPS刺激24 h，PBS作為對照組。提取細胞上清液(4℃ 1 500 rpm 10 min)，檢測細胞培養上清液中IL-6 表達水平，數據以pg/ml表示。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 CCK-8檢測不同濃度LPS對細胞增殖的影響

為了探討不同濃度LPS在不同時間點對于細胞增殖的影響，我們通過CCK-8實驗在6、12、24 h分別檢測了不同濃度 LPS(0-60 μg/ml)作用下L929和RAW264.7細胞增殖情況。兩種細胞在450 nm波長下的吸光度值如圖1所示。

A:L929 B:RAW264.7 細胞分別用0、10、20、30、40、50、60 μg/ml LPS刺激0、6、12、24 h后CCK-8檢測細胞增殖率。**P<0.01

L929細胞在(10-40 μg/ml) LPS作用6 h時與0 h對照組相比，增殖率無顯著變化(P>0.05)；而LPS濃度大于50 μg/ml時，細胞增殖率逐漸下降。當不同濃度LPS作用12 h時，細胞的生長曲線變化與6 h相似，說明LPS在短時間作用下對細胞的生長起持續抑制作用。當LPS刺激24 h，濃度小于20 μg/ml時，細胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而隨著濃度的增加(30-50 μg/ml)，細胞增殖率開始下降；濃度到達50 μg/ml時，細胞增殖趨于平穩，說明LPS刺激能夠引起細胞增長而高濃度則會抑制細胞的生長。因此在以后的實驗中我們選擇50 μg/ml LPS刺激24 h來檢測小鼠L929細胞炎癥因子的變化情況(圖1A)。

RAW264.7細胞在LPS作用6 h，濃度小于10 μg/ml時，與0 h對照組相比，細胞增殖率升高。而LPS濃度增加對于細胞增殖無顯著影響。不同濃度LPS刺激12 h細胞生長的曲線變化與6 h相似，說明在短時間內LPS能夠促進細胞增殖。當LPS刺激24 h，濃度小于50 μg/ml時，細胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而大于50 μg/ml時，細胞增殖率有所回落，說明長時間LPS刺激能夠引起細胞明顯增長而高濃度對細胞生長有抑制作用(圖1B)。

2.2 RT-PCR檢測L929細胞炎癥因子、趨化因子及相關基因的表達變化水平

LPS(50 μg/ml)刺激24 h 檢測TNF及炎癥因子IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-33 mRNA表達水平。結果顯示，與0 h相比，50 μg/ml的LPS刺激細胞24 h后，促炎因子TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-33 的表達分別升高9.6、10.0、5.8、3.0、4.4倍，說明LPS刺激24 h能夠引起炎癥反應；而IL-6,IL-23沒有發生明顯變化。反之，抗炎因子IL-10、IL-13表達均下降了0.6倍，進一步證明炎癥的發生。見圖2。

50 μg/ml LPS刺激L929細胞24 h后，RT-PCR檢測細胞炎癥因子的表達變化。相對mRNA表達倍數：50 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達量。

圖2L929細胞炎癥因子mRNA的表達量

此外，我們還檢測了此炎癥模型中趨化因子及相關基因的表達情況。結果發現，趨化因子CXCL2和轉換生長因子GDF15 mRNA的表達分別升高5.2、6.9倍，說明LPS引起了炎癥的發生，促進了CXCL2和GDF15的產生。而在LPS作用下轉錄因子FOXO3和趨化因子CXCL10的mRNA表達無明顯變化(圖3)。

2.3 ELISA檢測細胞培養上清中IL-6的變化水平

如圖4A 所示，用50 μg/ml LPS刺激L929細胞12、24、48 h，細胞上清中炎癥因子IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到13.69pg/ml(12小時)、45.52 pg/ml(48小時)；100 μg/ml LPS刺激下IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到7.00 pg/ml(12小時)、21.29 pg/ml(48小時)；說明LPS能夠引起L929細胞發生炎癥反應。相同刺激時間內50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細胞分泌IL-6的含量多，說明LPS刺激L929細胞引起的炎癥反應而分泌的IL-6不隨著LPS濃度的升高而增加。

50 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h，RAW264.7細胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、6.03、12.44、25.90、28.92 pg/ml；用100 μg/ml LPS刺激L929細胞0、6、12、24、48 h，細胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、4.76、10.10、10.09、16.90、18.21 pg/ml，說明LPS刺激能夠引起巨噬細胞發生免疫應答。與L929細胞一致，相同刺激時間內50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細胞分泌IL-6的含量多(圖4B)。

50 μg/ml LPS刺激L929細胞24 h后，RT-PCR檢測細胞趨化因子及相關基因的表達變化。相對mRNA表達倍數：50 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達量。

圖3L929細胞趨化因子及相關基因mRNA的表達量

A:L929 B:RAW264.7 細胞分別用0、50、100 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h后，ELISA檢測細胞炎癥因子IL-6的含量變化。**P<0.01

3 討論

口腔頜面部間隙感染是最常見的繼發性口腔急性病癥之一。由于頜面部軟組織相互交錯，之間存在不等量的疏松結締組織和脂肪，并且包含豐富的淋巴及血液循環與之相通[6]。因此當發生感染時，疏松的結締組織變性液化，形成膿腫，在疏松結締組織內相互融通可以波及鄰近間隙，進一步形成彌散性蜂窩織炎，嚴重感染者可引起全身中毒癥狀如膿毒血癥，最后危及生命。由于疏松結締組織是感染發生的關鍵部位，其存在成纖維細胞的活化表型，并且感染的發生可以使成纖維細胞活化，產生大量的促炎因子和趨化因子等，還能使其與中性粒細胞發生粘附作用，從而促進炎癥的發生[6]，因此我們選擇了小鼠結締組織成纖維細胞L929作為口腔頜面部感染體外模型的研究對象，利用這一細胞株研究了細菌感染對于細胞炎癥因子的影響。

脂多糖是G-細菌細胞壁中的一種成分，脂多糖對宿主有毒性[7]。黃鋼等人用LPS誘導U937(組織細胞淋巴瘤細胞)構建成了炎癥模型，用LPS刺激U937，收集細胞上清液和細胞團塊，采用ELISA檢測其中B7-H1的表達，從而證明了LPS建立感染模型的成立[8]。鏈球菌和金黃色葡萄球菌是在成人口腔頜面部感染中最常檢出的細菌[9]，LPS能夠識別分子在自然免疫的動態程序中發揮的作用。正因如此，我們選擇LPS作為口腔頜面部感染模型中的治病因素[10]，由LPS誘導L929感染招募了巨噬細胞的聚集，使巨噬細胞等免疫細胞釋放某些炎癥因子，造成細菌對組織和細胞的傷害要比自身對機體的影響更嚴重。

巨噬細胞是一種免疫細胞，它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行吞噬以及消化，并激活淋巴或相應的免疫細胞，令其對病原體作出反應[11]。張娜等人用LPS刺激巨噬細胞，構建感染模型證明 Foxo1 轉錄因子參與巨噬細胞引起的炎癥反應。RAW264.7為小鼠腹腔巨噬細胞細胞株，在炎癥細胞模型中常見[12]。我們研究在RAW264.7免疫細胞中可檢測到炎癥細胞因子的同時，也在L929 中檢測到相關炎癥因子，可以表明有感染和炎癥的存在。

在炎癥反應當中，主要致菌因素大多為細菌感染，所以在炎癥環境下，常含有大量的細菌代謝產物，從而細胞釋放出一些細胞炎癥因子，可以趨化中性粒細胞、T細胞、嗜酸性粒細胞等向受感染的組織遷移[13]，這些細胞和炎性細胞因子是引起炎癥慢性化和組織損傷的重要因素。本實驗研究中LPS可視為常見的金黃色葡萄球菌，用LPS感染L929結締組織成纖維細胞初步模擬了體外感染模型，證實了金黃色葡萄球菌感染誘導炎癥細胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IL-33、CXCL2、CXCL10、GEF1B、GDF15 在頜面部感染中的表達變化，為臨床上治療口腔頜面部感染提供了實驗依據。

參考文獻：

[1]李佳偉，蔡協藝.口腔頜面部間隙感染病原菌研究現狀[J].口腔頜面外科雜志，2013,23(3)：225.

[2]Hsieh SF,Chou CT,Liang WZ,et al.The Effect of Magnolol on Ca2+Homeostasis and Its Related Physiology in Human Oral Cancer Cells[J].Arch Oral Biol,2018,89:49.

[3]白 虹，謝蜀生.炎癥性細胞因子在沙眼衣原體肺感染中的表達及其與機體防御的關系[J].免疫學雜志,2004，20(4):274.

[4]Karta MR,Gavala ML,Curran CS,et al.Lps Modulates Rhinovirus-Induced Chemokine Secretion in Monocytes and Macrophages[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,51(1):125.

[5]曹承華，賀雅靜，高熒苒，等.LPS 介導的炎癥反應過程及作用機制[J].河南大學學報(醫學版),2017,36(1);70.

[6]Kaushansky K,Lin N,Adamson JW.Interleukin 1 Stimulates Fibroblasts to Synthesize Granulocyte-Macrophage and Granulocyte Colony-Stimulating Factors.Mechanism for the Hematopoietic Response to Inflammation[J].J Clin Invest,1988,81(1):92.

[7]Ma CY,Shi GY,Shi CS,et al.Monocytic Thrombomodulin Triggers Lps- and Gram-Negative Bacteria-Induced Inflammatory Response[J].J Immunol,2012,188(12):6328.

[8]黃 鋼，姜 曼，白 云.LPS 調節 U937 細胞上 B7-H1 表達的初步研究[J].免疫學雜志，2006,22(5)：480.

[9]Clayton A,Evans RA,Pettit E,et al.Cellular activation through the ligation of intercellular adhesion molecule-1[J].J Cell Sci,1998,111:443453.

[10]朱 珊，宋紹華，李學玉，等.口腔頜面部間隙感染的病原學分析及危險因素研究[J].中華醫院感染學雜志,2017,27(13);3052.

[11]徐志鵬,左國平，靳建亮.巨噬細胞異質性及其在炎癥調控中的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(12):1711.

[12]張 娜，張紫燕，趙凌霞，等.FoxO1轉錄因子在巨噬細胞中的表達與炎癥的關系[J].系統醫學,2016,1(9)：1.

[13]Olas K.Immunomodulatory properties of human serum immunoglobulin A:anti-inflammatory and pro-inflammatory activities in human monocytes and peripheral blood mononuclear cells[J].Clin Exp Immunol,2005,140(3):478.