口腔頜面部細(xì)菌感染體外模型的建立

史慶怡,孔晨飛,王曉峰*, 張?zhí)旆?

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.口腔科;2.科學(xué)研究中心，吉林 長春130033)

口腔頜面部感染在早期沒有得到有效的治療，會引發(fā)頜面部感染，可并發(fā)頜面蜂窩織炎、下頜骨骨髓炎等，甚至導(dǎo)致全身性的感染，嚴(yán)重者會威脅生命[1]。急性炎癥涉及多個環(huán)節(jié)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫介質(zhì)網(wǎng)絡(luò),其中以促炎癥因子TNF-α、IL-1 以及IL-6 等前炎癥細(xì)胞因子最為重要[2，3]。TNF-α、IL-1 和IL-6被早期應(yīng)答觸發(fā),通過上調(diào)黏附分子和趨化因子的表達(dá)而吸引炎癥細(xì)胞循環(huán),在宿主防御微生物感染中起重要作用[4]。本次實驗中，我們利用細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929初步模擬了體外口腔頜面部感染模型[5]，應(yīng)用CCK-8、PCR和ELISA等方法檢測了不同時間點細(xì)胞培養(yǎng)基上清中炎癥因子及趨化因子等相關(guān)基因的表達(dá)變化。并檢測了LPS刺激后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對感染的應(yīng)答情況，探討炎癥刺激對于機體及免疫細(xì)胞的影響，為口腔頜面部感染后的早期診斷和治療提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心)。RPMI-1640、IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶(美國Gibco 公司)；RNA 提取試劑Trizol (美國Invitrogen公司)；premix Taq(Roche公司)；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、LPS(Sigma公司)；IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

L929、RAW264.7細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的IMEM、1640培養(yǎng)液中(含10% 青霉素和鏈霉素)，37 ℃ 5% CO2。2-3天傳代1次。細(xì)胞鋪于的6孔板中,待細(xì)胞擴增至70 %-80 %時,用PBS 沖洗3 次,加入含有LPS(50 μg/ml)的IMDM(不含胎牛血清和雙抗)的培養(yǎng)液培養(yǎng),分別培養(yǎng)6、12、24小時。PBS作為對照組。

1.3 CCK-8實驗

細(xì)胞以2×103細(xì)胞/孔密度接種于96孔板中，復(fù)種2孔，37℃ 5% CO2過夜。分別加入20、30、40、50、60 μg/ml LPS，培養(yǎng)6、12、24 h后，加入CCK-8檢測450 nm處OD值。取3孔平均值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

采用Trizol試劑提取總RNA，以200-500 ng RNA為cDNA合成標(biāo)準(zhǔn)。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s。而后進(jìn)行QPCR定量檢測。利用基因特異引物PCR檢測不同循環(huán)RNA研究的描述的表達(dá)水平。用2(-DDCT)法計算相關(guān)基因的表達(dá)。相關(guān)引物如下：

GAPDH,上游引物序列：5’-GTCGTACCACACGGCATTGTATGG-3’,下游引物序列：5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’,

TNF,上游引物序列：5’-GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’,下游引物序列：5’-GAATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGC-3’,

IL-1,上游引物序列5’-ACGAAGACTACAGTTCTGCCATTGAC -3’,下游引物序列：5’-AGCCTCATCGTCTCATTGCTTGTC -3’,

IL-6,上游引物序列：5’-AGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG -3’,下游引物序列：5’-CATGTGTAATTAAGCCTCCGACTTGTG -3’,

IL-8,上游引物序列：5’-GCTGCTCAAGGCTGGTCCATG-3’,下游引物序列：5’-TGTTCCTGAATACACAGACATCGTAGC-3’,

IL-10，上游引物序列：5’-CTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3’,下游引物序列：5’-GAGTCGGTTAGCAGTATGTTGTCCAG-3’,

IL-23,上游引物序列：5’-GCACCTGCTTGACTCTGACATCTTC-3’,下游引物序列：5’-TGGCTGGAGGAGTTGGCTGAG-3’,

IL-33,上游引物序列：5’-AGACCAGGTGCTACTACGCTACTATG-3’,下游引物序列：5’-ACTCATGTTCACCATCAGCTTCTTCC-3’,

CXCL2,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-GCGTCACACTCAAGCTCTGGATG-3’,

CXCL10,上游引物序列：5’-GACGGTCCGCTGCAACTGC-3’,下游引物序列：5’-CCGGATTCAGACATCTCTGCTCATC-3’,

GDF15,上游引物序列：5’-GAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAG-3’,下游引物序列：5’-TCGGCGTCAGCAGGAGCAG-3’,

FOXO3,上游引物序列：5’-CCGTGAGCAAGCCGTGTACTG-3’,下游引物序列：5’-TATCCAGCAGGTCGTCCATGAGG-3’。

1.5 ELISA法測定細(xì)胞因子水平

細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔密度接種于24孔板中，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，每孔加入50 μg/ml LPS刺激24 h，PBS作為對照組。提取細(xì)胞上清液(4℃ 1 500 rpm 10 min)，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6 表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以pg/ml表示。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測不同濃度LPS對細(xì)胞增殖的影響

為了探討不同濃度LPS在不同時間點對于細(xì)胞增殖的影響，我們通過CCK-8實驗在6、12、24 h分別檢測了不同濃度 LPS(0-60 μg/ml)作用下L929和RAW264.7細(xì)胞增殖情況。兩種細(xì)胞在450 nm波長下的吸光度值如圖1所示。

A:L929 B:RAW264.7 細(xì)胞分別用0、10、20、30、40、50、60 μg/ml LPS刺激0、6、12、24 h后CCK-8檢測細(xì)胞增殖率。**P<0.01

L929細(xì)胞在(10-40 μg/ml) LPS作用6 h時與0 h對照組相比，增殖率無顯著變化(P>0.05)；而LPS濃度大于50 μg/ml時，細(xì)胞增殖率逐漸下降。當(dāng)不同濃度LPS作用12 h時，細(xì)胞的生長曲線變化與6 h相似，說明LPS在短時間作用下對細(xì)胞的生長起持續(xù)抑制作用。當(dāng)LPS刺激24 h，濃度小于20 μg/ml時，細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而隨著濃度的增加(30-50 μg/ml)，細(xì)胞增殖率開始下降；濃度到達(dá)50 μg/ml時，細(xì)胞增殖趨于平穩(wěn)，說明LPS刺激能夠引起細(xì)胞增長而高濃度則會抑制細(xì)胞的生長。因此在以后的實驗中我們選擇50 μg/ml LPS刺激24 h來檢測小鼠L929細(xì)胞炎癥因子的變化情況(圖1A)。

RAW264.7細(xì)胞在LPS作用6 h，濃度小于10 μg/ml時，與0 h對照組相比，細(xì)胞增殖率升高。而LPS濃度增加對于細(xì)胞增殖無顯著影響。不同濃度LPS刺激12 h細(xì)胞生長的曲線變化與6 h相似，說明在短時間內(nèi)LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)LPS刺激24 h，濃度小于50 μg/ml時，細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)；而大于50 μg/ml時，細(xì)胞增殖率有所回落，說明長時間LPS刺激能夠引起細(xì)胞明顯增長而高濃度對細(xì)胞生長有抑制作用(圖1B)。

2.2 RT-PCR檢測L929細(xì)胞炎癥因子、趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)變化水平

LPS(50 μg/ml)刺激24 h 檢測TNF及炎癥因子IL-1、IL-5、IL-6、IL-8、IL-33 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與0 h相比，50 μg/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h后，促炎因子TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-33 的表達(dá)分別升高9.6、10.0、5.8、3.0、4.4倍，說明LPS刺激24 h能夠引起炎癥反應(yīng)；而IL-6,IL-23沒有發(fā)生明顯變化。反之，抗炎因子IL-10、IL-13表達(dá)均下降了0.6倍，進(jìn)一步證明炎癥的發(fā)生。見圖2。

50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞24 h后，RT-PCR檢測細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化。相對mRNA表達(dá)倍數(shù)：50 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達(dá)量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達(dá)量。

圖2L929細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)量

此外，我們還檢測了此炎癥模型中趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL2和轉(zhuǎn)換生長因子GDF15 mRNA的表達(dá)分別升高5.2、6.9倍，說明LPS引起了炎癥的發(fā)生，促進(jìn)了CXCL2和GDF15的產(chǎn)生。而在LPS作用下轉(zhuǎn)錄因子FOXO3和趨化因子CXCL10的mRNA表達(dá)無明顯變化(圖3)。

2.3 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的變化水平

如圖4A 所示，用50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞12、24、48 h，細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到13.69pg/ml(12小時)、45.52 pg/ml(48小時)；100 μg/ml LPS刺激下IL-6 含量從0.75 pg/ml分別上升到7.00 pg/ml(12小時)、21.29 pg/ml(48小時)；說明LPS能夠引起L929細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。相同刺激時間內(nèi)50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細(xì)胞分泌IL-6的含量多，說明LPS刺激L929細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)而分泌的IL-6不隨著LPS濃度的升高而增加。

50 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h，RAW264.7細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、6.03、12.44、25.90、28.92 pg/ml；用100 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞0、6、12、24、48 h，細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6 含量分別為0.007、4.76、10.10、10.09、16.90、18.21 pg/ml，說明LPS刺激能夠引起巨噬細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答。與L929細(xì)胞一致，相同刺激時間內(nèi)50 μg/ml LPS比100 μg/ml LPS刺激細(xì)胞分泌IL-6的含量多(圖4B)。

50 μg/ml LPS刺激L929細(xì)胞24 h后，RT-PCR檢測細(xì)胞趨化因子及相關(guān)基因的表達(dá)變化。相對mRNA表達(dá)倍數(shù)：50 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達(dá)量/0 μg/ml LPS刺激24 h相對mRNA表達(dá)量。

圖3L929細(xì)胞趨化因子及相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量

A:L929 B:RAW264.7 細(xì)胞分別用0、50、100 μg/ml LPS刺激0、6、12、24、48 h后，ELISA檢測細(xì)胞炎癥因子IL-6的含量變化。**P<0.01

3 討論

口腔頜面部間隙感染是最常見的繼發(fā)性口腔急性病癥之一。由于頜面部軟組織相互交錯，之間存在不等量的疏松結(jié)締組織和脂肪，并且包含豐富的淋巴及血液循環(huán)與之相通[6]。因此當(dāng)發(fā)生感染時，疏松的結(jié)締組織變性液化，形成膿腫，在疏松結(jié)締組織內(nèi)相互融通可以波及鄰近間隙，進(jìn)一步形成彌散性蜂窩織炎，嚴(yán)重感染者可引起全身中毒癥狀如膿毒血癥，最后危及生命。由于疏松結(jié)締組織是感染發(fā)生的關(guān)鍵部位，其存在成纖維細(xì)胞的活化表型，并且感染的發(fā)生可以使成纖維細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的促炎因子和趨化因子等，還能使其與中性粒細(xì)胞發(fā)生粘附作用，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[6]，因此我們選擇了小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929作為口腔頜面部感染體外模型的研究對象，利用這一細(xì)胞株研究了細(xì)菌感染對于細(xì)胞炎癥因子的影響。

脂多糖是G-細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，脂多糖對宿主有毒性[7]。黃鋼等人用LPS誘導(dǎo)U937(組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)構(gòu)建成了炎癥模型，用LPS刺激U937，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞團塊，采用ELISA檢測其中B7-H1的表達(dá)，從而證明了LPS建立感染模型的成立[8]。鏈球菌和金黃色葡萄球菌是在成人口腔頜面部感染中最常檢出的細(xì)菌[9]，LPS能夠識別分子在自然免疫的動態(tài)程序中發(fā)揮的作用。正因如此，我們選擇LPS作為口腔頜面部感染模型中的治病因素[10]，由LPS誘導(dǎo)L929感染招募了巨噬細(xì)胞的聚集，使巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放某些炎癥因子，造成細(xì)菌對組織和細(xì)胞的傷害要比自身對機體的影響更嚴(yán)重。

巨噬細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬以及消化，并激活淋巴或相應(yīng)的免疫細(xì)胞，令其對病原體作出反應(yīng)[11]。張娜等人用LPS刺激巨噬細(xì)胞，構(gòu)建感染模型證明 Foxo1 轉(zhuǎn)錄因子參與巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。RAW264.7為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞株，在炎癥細(xì)胞模型中常見[12]。我們研究在RAW264.7免疫細(xì)胞中可檢測到炎癥細(xì)胞因子的同時，也在L929 中檢測到相關(guān)炎癥因子，可以表明有感染和炎癥的存在。

在炎癥反應(yīng)當(dāng)中，主要致菌因素大多為細(xì)菌感染，所以在炎癥環(huán)境下，常含有大量的細(xì)菌代謝產(chǎn)物，從而細(xì)胞釋放出一些細(xì)胞炎癥因子，可以趨化中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等向受感染的組織遷移[13]，這些細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子是引起炎癥慢性化和組織損傷的重要因素。本實驗研究中LPS可視為常見的金黃色葡萄球菌，用LPS感染L929結(jié)締組織成纖維細(xì)胞初步模擬了體外感染模型，證實了金黃色葡萄球菌感染誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IL-33、CXCL2、CXCL10、GEF1B、GDF15 在頜面部感染中的表達(dá)變化，為臨床上治療口腔頜面部感染提供了實驗依據(jù)。

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