兩種心肌纖維化動物模型基本情況比較

徐為民，孫 志，陳 歡，時景偉

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

心肌纖維化動物模型在心血管疾病基礎實驗中占有重要地位，目前較常見的實驗動物心肌纖維化造模方法有：自發性高血壓大鼠心肌纖維化、糖尿病大鼠心肌纖維化、二腎一夾及腎下主動脈縮窄模型、腹主動脈縮窄法等，其中主動脈縮窄法是近幾年較為主流的心肌纖維化及心衰造模方法，本文將主動脈縮窄法與經典的異丙腎上腺素法作一簡單比較，初步探討兩者的優勢與缺點。

1 材料與方法

1.1動物BALB/c雄性SPF級小鼠40只，體重17-24 g，約8周齡，由吉林大學實驗動物中心提供，實驗過程符合動物倫理學標準。

1.2試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海豐禾制藥有限生公司生產)，異氟烷(德國費森尤斯公司生產)，小動物麻醉系統(加拿大Visualsonics公司)，小動物超聲(加拿大Visualsonics公司)。羊抗小鼠UII(尾加壓素Ⅱ)單克隆抗體、羊抗小鼠GPR14(尾加壓素受體)多克隆抗體(由Santa Cruz公司提供)； SP-免疫細胞化學試劑盒(由北京中衫金橋生物技術有限公司提供)等。

1.3造模40只小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、異丙腎組、sham組和TAC組。異丙腎組腹部皮下注射Iso10 mg/kg，每天1次，正常對照組，每天皮下注射生理鹽水，TAC組于異氟烷麻醉下行胸切口，主動脈弓瞬時夾閉手術，Sham組只行開胸及縫合，不做主動脈弓夾閉。至1周時，每組隨機取5只，行心臟彩超后摘取心臟進行染色。至3周時，同樣處置。

1.4心臟彩超將小鼠置于加熱板上保持體溫恒定，適當調整超聲探頭以獲取胸骨旁長軸圖像，測量左心室舒張末期內徑(LVEDD)，左心室收縮末期內徑(LVESD)，左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短分數(LVFS)。

1.5方法HE、天狼星紅染色，按常規染色法進行操作。免疫組織化學染色按試劑盒說明書操作。 染色后在每張切片左心室尖部隨機選取5個高倍鏡視野(×200)，用病理圖像分析系統對所選視野內陽性信號進行圖像分析，計算不同時間點的各組小鼠心肌組織陽性信號吸光度(A)。

2 結果

2.1一般情況正常對照組及sham組小鼠一般狀態佳，行為敏捷，皮毛光滑茂盛。異丙腎組3天時死亡1只，3周時死亡一只，其余8只精神萎糜，有明顯掉毛，行為遲緩，食欲明顯減退。TAC組手術時死亡1只，術后24小時死亡一只，其余8只精神略萎糜，輕度掉毛，活動度較異丙腎組略好。Sham組手術時死亡一只，其余9只活動度及食欲均良好。

2.2心臟彩超異丙腎組造模1周時只有左室舒張末期內徑明顯增大，左室射血分數明顯下降，而3周時四項指標均明顯變化。而主動脈縮窄組在一周時只表現為左室射血分數下降，至三周時四項指標也出現顯著變化。異丙腎組和TAC組在第一周的指標變化沒有差距，而在第三周時均出現明顯差別。見表1。

2.3HE染色1周時正常對照組心肌細胞排列整齊，橫紋清晰，胞核染色明顯，無細胞腫脹。Sham組基本同正常對照組。異丙腎組則出現心肌細胞肥大，排列疏松紊亂，大小不一，細胞核大小不一，肌纖維增粗，散在壞死灶，部分區域肌纖維完全溶解，核異質性明顯，心肌間質可見纖維組織增生。TAC組也出現上述改變，但程度較輕，見圖1。3周時，正常對照組與Sham組無明顯變化。異丙腎組壞死病灶面積增大，病灶內出現較多纖維化，壞死程度明顯比1周時增大。TAC組壞死程度及纖維化程度較1周時明顯加重，但較異丙腎組為輕。見圖2。

**與正常對照組比較，P<0.01.##與sham組比較，P<0.01.&與異丙腎組比較，P<0.05.&&與異丙腎組比較，P<0.01

圖1 1周時各組心肌HE染色，A正常對照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

圖2 3周時各組心肌HE染色，A正常對照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

2.4天狼星紅染色1周時正常對照組心肌膠原表達較少，Sham組亦較少，異丙腎組膠原纖維組織輕度增生，心內膜下、間質中膠原沉積量輕度增加，TAC組無明顯增加。見圖3。3周時正常對照組與Sham組均無明顯變化，異丙腎組膠原明顯增加，TAC組也明顯增加，但較異丙腎組為輕。見圖4。

圖3 1周時各組心肌天狼星紅染色 A正常對照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

圖4 3周時各組心肌天狼星紅染色 A正常對照組，B 異丙腎組，C sham組，D TAC組

2.5UII及UT蛋白表達情況UII免疫組織化學染色顯示：正常對照組及sham組在心尖及心內膜可見極少量陽性表達的心肌細胞和成纖維細胞，且不隨時間延長而改變。1周后，異丙腎組及TAC組UII陽性產物即明顯增加，呈黃褐色(P<0.01)，3周后，這兩組UII陽性產物表達明顯比1周多(P<0.01)，且陽性產物主要分布在壞死灶周圍。UT免疫組化染色結果與UII同步。見圖5-8、表1。

圖5 1周時UII染色 A正常對照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖6 1周時UT染色 A正常對照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖7 3周時UII染色 A正常對照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

圖8 3周時UT染色 A正常對照組，B異丙腎組，C TAC組，D sham組

組別正常對照組(n=10)1周(n=5)3周(n=5)異丙腎組(n=8)1周(n=4)3周(n=4)Sham組(n=9)1周(n=4)3周(n=5)TAC組(n=8)1周(n=3)3周(n=5)UⅡ(A*103)2.63±0.242.74±0.1815.78±2.96**16.81±3.12**2.76±0.182.81±0.216.27±0.70##13.56±2.24##UT(A*103)2.8±0.82.9±1.015.9±4.1**17.9±3.9**2.9±0.73.0±0.87.5±1.2##14.6±3.1##

**與正常對照組比較P<0.01.##與sham組比較P<0.01.

3 討論

異丙腎上腺素使小鼠心率加快，心率持續強烈收縮，心肌因相對缺血導致壞死及纖維化，出現心臟功能衰竭[1]。而主動脈縮窄法造成心臟壓力負荷增加，心肌逐漸肥厚、重塑，最終造成心功能惡化[2]。

本研究首次將此兩種方法進行對比，通過HE和天狼星紅染色結果可以看出，在同樣的周期下，異丙腎上腺素法致心肌纖維化程度較主動脈縮窄法高，這可能與異丙腎上腺素的劑量變異性較大有關[3,4]，也可能由于心肌缺血和高血壓導致心肌纖維化的機制略有不同[5]。具體原因尚待進一步探討。

本實驗的心臟彩超結果提示，異丙腎組對心臟功能的影響出現較早且較顯著，這與其他學者的研究相當[6]，而主動脈縮窄法對心臟形態和功能的影響在3周時均不明顯。根據其他研究團隊的結論，TAC法需要4-6周才能出現對左室大小、EF和FS的顯著影響[2]。

在本研究中，TAC組的死亡率與ISO組相當，TAC組與sham組死亡小鼠主要死于術中及術后并發癥，提示TAC的手術風險高，技術難度大，但ISO組對小鼠機體損傷更大。此結論尚需大例數試驗證實。

心肌纖維化(MF)主要表現為心肌膠原濃度顯著升高，涉及RAAS(腎素-血管緊張素-醛固酮)系統及免疫系統參與，多種細胞因子、細胞信號傳導系統均與MF發生有關[7]。兩組均出現UII及UT的蛋白表達升高，說明在心肌缺血及高血壓導致的心肌纖維化機制中，均有尾加壓素Ⅱ及其受體的參與，這已在多個研究中被證明[8-11]。

綜上所述，異丙腎造模法造模速度快、周期短、技術難度低，但造模過程中小鼠死亡率較高，可作為急性心肌纖維化研究模型。而主動脈縮窄法雖然技術要求高、造模速度慢，但致死率相對略低，適宜作為慢性心肌纖維化模型進行試驗。

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