腦苷肌肽對有機磷中毒性遲發性神經病變大鼠學習記憶能力及血漿鈣激活的中性蛋白酶、神經疾病靶標酯酶影響研究*

王 寧，張艷盛，王夢夢

1.河北省滄州市中心醫院神經電生理科(滄州061001)，2.河北省滄州市中心醫院檢驗科(滄州061001)

有機磷農藥中毒不僅表現出膽堿酯酶活性抑制現象，還會表現出其他神經毒性作用，這種神經病變發生在中毒急性期以后，因此被稱為有機磷中毒性遲發性神經病變(OPIDN)。OPIDN的臨床表現包括運動障礙、感覺障礙、行走困難、步態失調和一些外周神經的組織病變[1-2]。臨床上，中毒急性期的癥狀消失之后患者中毒史容易被忽略，給OPIDN的診斷和治療帶來很多困難。有研究認為[3-4]，OPIDN的出現與中毒者血漿組織中神經疾病靶標酯酶(NTE)和鈣激活的中性蛋白酶(CANP)的水平變化存在關聯。組織中NTE受到抑制將會導致組織細胞出現“衰老”的改變，且這種改變是由CANP介導的。不僅如此，OPIDN還會造成患者認知功能障礙[5]。目前對OPIDN普遍采用大劑量B族維生素進行治療，但是療效并不確切，進來研究發現，腦苷肌肽可以通過提高神經細胞的存活率在OPIDN的治療中發揮作用[6]。本研究就旨在探討腦苷肌肽注射液對有OPIDN大鼠學習記憶能力及血漿CANP、NTE的影響。從而為OPDIN的治療提供數據支持。

材料與方法

1 實驗動物 選擇一級雄性SD大鼠135只，月齡2.5～4個月，平均(3.1±0.6)個月，質量(200±20)g，由河北醫科大學實驗動物飼養中心提供。所有大鼠在研究期間均飼養與20～25℃條件下，給予普通顆粒飼料和自來水。

2 動物篩選 自制Y型電迷宮[7]，迷宮其中一臂作為起點，通電后會給予大鼠電刺激信號，另外兩臂中，一臂給予燈光信號指示，為安全區，一臂無燈光信號指示，為危險區，通電后也會給予大鼠電刺激信號。分別將所有大鼠置于起點，通電后大鼠直接跑向安全區為正確反應，否則為錯誤反應。當大鼠達到安全區域后，停留1 min鞏固大鼠記憶，而后熄滅燈光信號，開始下一次訓練。所有大鼠每日接受10次相同訓練，共連續進行7 d。第8天對大鼠進行篩選，大鼠重復相同的訓練，10次中有9次及其以上給出正確反應的大鼠入選研究。最終有132只大鼠入選研究。

3 動物模型制備 在所有入選的大鼠中，隨機挑選30只作為空白組。剩余102只大鼠接受樂果乳油造模，具體操作步驟如下：所有大鼠接受一次性腹腔注射樂果乳油300 mg/(kg·d)，以對其染毒。染毒后密切觀察大鼠的體態體征和健康狀況。急性期大鼠表現出站立不穩、肌束顫動和呼吸急促，并出現越來越嚴重的肌無力現象。102只大鼠中有3只在中毒急性期死亡，繼續觀察剩余99只染毒大鼠。染毒2周后大鼠表現出伏地雙足距離增加，后腿無法支持軀干、后肢癱瘓等OPIDN癥狀。此時，對99只染毒大鼠按OPIDN癥狀進行分級：大鼠完全癱瘓為3級、后臀站立為2級、步態異常為1級、無體征為0級。選擇屬于2、3級的90只大鼠，將其隨機分為對照組、甲鈷胺組和聯合治療組，每組各30只。四組大鼠均入選后開始研究。

4 動物模型的藥物干預 甲鈷胺組大鼠開始研究后每日給予1.25 mg/(kg·d)甲鈷胺片劑，溶解在1 ml/kg蒸餾水中，灌胃給藥?？瞻捉M和對照組大鼠在開始研究后每日給予等量蒸餾水灌胃。聯合組大鼠給予與甲鈷胺組大鼠相同的灌胃治療，在此基礎上每日早晚兩次肌肉注射腦苷肌肽1.25 ml/(kg·d)。所有大鼠的干預周期均為4周。

5 動物模型藥物干預前后NTE和CANP的監測與記憶能力測定 ①治療前、治療后2、4周大鼠血漿中NTE和CANP水平：分別在藥物干預前、治療后2、4周分別取5只大鼠，腹腔注射0.3 ml/(kg·d)的10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉后開胸取大鼠右心室血漿后處死，采用酶聯免疫吸附法檢測血漿中NTE和CANP水平；②治療4周后大鼠記憶再現能力測試：治療4周后給予所有剩余大鼠相同的Y型電迷宮和燈光信號指示，每只大鼠均連續測試10次，記錄大鼠出現正確反應的次數。觀察兩組給藥大鼠在整個實驗過程中出現的生理和形態變化。

6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件對本研究各動物實驗組NTE和CANP水平和記憶再現能力和再現次數的前后差異比較。對四組大鼠的所有NTE和CANP水平采用方差分析進行處理，記憶再現正確反應次數采用秩和檢驗。以P<0.05差異具有統計學意義。

結 果

1 不同時間點大鼠血漿NTE蛋白水平 見表1。

表1 不同時間點大鼠血漿NTE蛋白水平(pg/ml)

染毒大鼠干預前血漿NTE蛋白水平顯著低于空白組大鼠(P<0.05)，甲鈷胺組和聯合組大鼠治療后血漿NTE水平上升(P<0.05)，其中聯合組大鼠治療后血漿NTE水平最高(P<0.05)。

2 不同時間點大鼠血漿CANP蛋白水平 見表2。染毒大鼠干預前血漿CANP蛋白水平顯著高于空白組大鼠(P<0.05)，甲鈷胺組和聯合組大鼠治療后血漿CANP水平下降(P<0.05)，其中聯合組大鼠治療后血漿CANP水平最低(P<0.05)。

表2 不同時間點大鼠血漿CANP蛋白水平(ng/ml)

3 大鼠記憶再現能力測試結果 見表3。染毒后的三組大鼠中，聯合組大鼠記憶再現能力最佳(P<0.05)。

表3 大鼠記憶再現能力測試結果

4 藥物不良反應 兩組給藥大鼠給藥后均未出現明顯體態和生理變化。

討 論

有機磷作為一種神經毒性藥物，在我國農業和林業生產中運用廣泛，近年來國家越發重視對有機磷中毒的研究。有機磷中毒患者不僅會出現中毒急性期癥狀，中毒2～3周以后還會出現OPIDN。OPIDN可以稱為有機磷中毒最嚴重的并發癥，且OPIDN的發生與單次有機磷暴露量無關，而與機體有機磷暴露總量有關，即使是多次小劑量的與有機磷接觸，患者不出現急性中毒的臨床癥狀，也有很大概率出現OPIDN[8]。目前臨床上對OPIDN的治療還沒有特效藥物，治療多采用大劑量B族維生素、三磷酸腺苷、地巴唑、高壓氧及針灸等營養神經，改善周圍循環等治療方案，但療效不確切。本研究在目前臨床常用甲鈷胺的基礎上合用了腦苷肌肽注射液來對OPIDN大鼠進行治療。

從大鼠的記憶再現功能上來看，聯合治療的大鼠記憶再現功能顯著優于甲鈷胺單獨治療大鼠。OPIDN大鼠的記憶再現功能較正常大鼠明顯下降，這應當與染毒大鼠腦部神經細胞排列雜亂、稀疏有關，大鼠染毒后大量神經元固縮變形，腦組織損傷嚴重[9]。腦苷肌肽是由健康家兔的肌肉提取物和牛腦的神經節苷脂提取物混合而成的注射液，含有多種游離氨基酸、多肽、核算和神經節苷脂等成分?？梢杂行Щ謴蜕窠浖毎难豕?、提高血紅細胞的載氧能力，提高神經元的存活能力和改善腦部微循環[10]。因此，進行過腦苷肌肽治療的大鼠記憶重現能力明顯優于只進行了甲鈷胺治療的大鼠。

本研究還對血漿中兩種與OPIDN相關的蛋白水平進行了檢測。NTE是一種單鏈蛋白質，研究顯示[11]，OPIDN的出現與機體內NTE與有機磷(OP)結合后老化的有關。OP可以選擇性的與NTE結合，并通過后續老化過程來抑制NTE活性，且這種抑制是不可逆的，這也解釋了少量多次接觸有機磷藥物后機體依然會出現OPIDN的原因。OP首先與NTE的活性位點結合，接著OP的烷基側鏈脫落與NTE活性位點附近的另一區域結合，完成老化過程，研究表示[12]，當70%以上的NTE被抑制時，將會出現OPIDN的臨床表現。本研究結果提示，染毒大鼠2周后血漿中NTE蛋白水平較空白組大鼠明顯下降，這是因為與OP結合后的老化的NET蛋白無法通過酶聯反應被檢測出來，因此血漿中具有正常生理功能的NTE水平持續下降。當OP選擇性的與NTE結合后，可造成酶末端發生一系列的生化變化，導致酶出現被稱為“衰老”的改變，兩者結合產生的物質穩定性高，不易水解。OP正是經過這一過程來達到消耗具有生理活性的NTE的目的。大鼠接受甲鈷胺治療后NTE蛋白水平上升緩慢，而接受腦苷肌肽治療后，NTE的水平可穩步上升。腦苷肌肽中具有生物活性的成分可能可以促進機體快速產生新的NTE來代替已經老化失活的NTE，從而發揮生理作用。

CANP是一類需要環境中的Ca2+進行激活的中性半胱氨酸水解酶。在健康機體中，CANP發揮著降解膜蛋白、細胞骨架蛋白和各種信號傳遞酶的作用。在細胞的增殖、生長、分化、骨架重建和凋亡中都發揮著重要作用。已有研究顯示，CANP在多種神經退行性疾病的發生和發展中起作用[13]。在本研究中，染毒大鼠2周后血漿中CANP蛋白水平較空白組大鼠顯著上升，由此說明，OPIDN的發生與CANP蛋白的過度活化有關。而CANP的活化需要環境中存在足夠濃度的Ca2+才能夠實現。OPIDN患者神經元遭到破壞，細胞膜通透性改變，胞漿中Ca2+大量入血，導致血漿內CANP的活性出現變化。CANP的活化導致了神經軸突末端的蛋白質過度水解，導致神經突觸間的信號傳導通路被破壞，進而導致OP中毒后生物體的多種神經功能障礙和損傷。可以推測，腦苷肌肽的運用，可以修復受損的神經細胞，重建細胞膜的屏障作用，促進神經干細胞的分化和增殖，維持神經代謝，恢復神經組織功能。因此聯合治療組大鼠治療后血漿中CANP水平得以迅速下降。

綜上所述，腦苷肌肽注射液對于OPIDN大鼠的記憶能力和神經細胞損傷修復均具有積極作用。

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