安替可膠囊對Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制作用及其抗血管生成作用的實驗研究

馬 薇，舒 慶，周 丹，趙小燕，付聯強，馬巖敏

西安市第九醫院藥劑科(西安 710054)

肺癌是目前人類病死率及發病率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤血管的生成作用在腫瘤組織的生長與轉移中均起到重要的促進作用[1]。因此，對腫瘤血管的生成作用進行有效的抑制已成為一種臨床腫瘤治療的新型方法[2]。安替可膠囊具有解毒鎮痛和養血活血等功效，臨床常用于胃癌等多類型惡性腫瘤的治療[3]。盡管有部分研究顯示安替可膠囊對鼻咽癌等非胃腸道癌癥亦具有較好的療效，但并無動物實驗結果對其進行深入證實，而對于該藥物用于肺癌治療的研究則更是鮮有報道。為此，筆者對安替可膠囊用于肺癌小鼠的治療作用進行了研究，并對其抗血管生成作用進行了探討，期望為肺癌的治療提供一種新的思路與方法。

材料與方法

1 儀 器 78UI型奧林匹斯顯微照相系統及Image-proplus 6.0 圖像分析軟件(日本奧林匹斯公司)；AS-1r型高速離心機(美國安捷倫公司)；Trans-Blot Turbo全能型半干式免疫蛋白轉印系統(美國Bio-Rad公司)。

2 試 劑 陽性藥索拉非尼：美國SIGMA公司；羧甲基纖維素鈉：美國SIGMA公司；一抗VEGF、ADAMTS1、HIF-1α及VEGFR-2抗體：美國SIGMA公司；二抗VEGF、ADAMTS1、HIF-1α及VEGFR-2抗體：美國SIGMA公司；微量BCA蛋白定量試劑盒：武漢博士德生物科技有限公司。

3 劑 量 根據文獻中對于人體與動物的劑量轉換公式[4]：小鼠灌胃給藥劑量(mg/kg)= 12.3×成人口服劑量(mg/kg)，安替可膠囊成人一般劑量為1.32 g/d[0.022 g/(kg·d)]，故小鼠的正常給藥劑量(mg/kg) = 0.022 g/(kg·d)×12.3 = 0.27 g/(kg·d)，并選取正常給藥劑量為低劑量組[0.27 g/(kg·d)]，2倍正常給藥劑量為高劑量組[0.54 g/(kg·d)]，而陽性藥索拉非尼成人一般劑量為0.8 g/d[0.013 g/(kg·d)]，故小鼠給藥劑量(mg/kg)= 0.013 g/(kg·d)×12.3 = 0.16 g/(kg·d)。

4 實驗細胞與動物 Lewis肺腺癌細胞，40只雄性清潔級C57BL/6小鼠，體重18～22 g，鼠齡6～8周，均購自陜西省疾病控制中心。將上述小鼠平均隨機分為：模型組、陽性藥組[索拉非尼0.16 g/(kg·d)]、低劑量組[0.27 g/(kg·d)]、高劑量組[0.54 g/(kg·d)]，每組10只。所有小鼠的飼養條件均為食物飲水不限制，晝夜各半，適應性喂養7 d后開展后續實驗。

5 造模及給藥方法[5]將Lewis肺腺癌細胞常規培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液中(pH=7.2)，采用無菌注射器將Lewis細胞0.2 ml接種于各組小鼠右腋下，接種1周后腫瘤長徑至7～8 mm時則造模成功。Lewis肺腺癌細胞接種1周后，將未成功造模的小鼠剔除，并對剩余小鼠進行給藥，而模型組則灌胃給予等量生理鹽水，連續給藥14 d。

6 觀察項目 ①各組小鼠一般情況觀察[6]：末次給藥24 h后，對各組小鼠進行稱重，稱重結束后將小鼠脫頸法處死，取其皮下腫瘤組織，稱取瘤體重量并檢測其長短徑，計算腫瘤體積及腫瘤抑制率，其中腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2，腫瘤抑制率=(模型組腫瘤體積-給藥組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積×100%。②各組小鼠腫瘤組織病理切片觀察：將上述各組小鼠的腫瘤組織分為兩部分，其中一部分腫瘤組織置于-80 ℃冰箱中保存備用。另一部分腫瘤組織則固定于4%多聚甲醛液中，以石蠟包埋、HE染色，并經過連續切片、烤片與封片等處理后對其病理組織學進行觀測。③各組小鼠瘤體VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α免疫熒光染色方法：?、谥斜４娴哪[瘤組織樣本，根據試劑盒說明書中VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α的免疫熒光染色方法進行操作，采用石蠟切片脫蠟、水化，并依次進行抗原修復、一抗結合、二抗結合、DAPI對細胞核進行復染及封片，將封好的切片放置于熒光顯微鏡中，并對其進行拍照與統計。

結 果

1 安替可膠囊對各組小鼠一般情況的影響 見表1。給藥后，與模型組比較，陽性藥組、高及低劑量組體重均明顯增加，腫瘤體積與腫瘤重量則明顯降低(P<0.05)。陽性藥組、高劑量組及低劑量組小鼠腫瘤生長抑制率分別為57.8%、50.0%及40.6%。

表1 安替可膠囊對各組小鼠一般情況的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

2 安替可膠囊對各組腫瘤組織病理學的影響 見圖1。模型組腫瘤組織中癌細胞大小均勻且形態與染色均正常。陽性藥組及高劑量組小鼠腫瘤組織中則可見癌細胞出現大面積的壞死與凋亡，低劑量組亦出現壞死，但壞死程度不及陽性藥組及高劑量組。

A：模型組;B：陽性藥組;C：高劑量組;D：低劑量組 圖1 各組小鼠腫瘤組織病理切片(HE染色×200)

3 安替可膠囊對各組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α表達的影響 見表2。模型組腫瘤組織中存在上述蛋白強陽性表達，陽性藥組、高及低劑量組相對表達量均明顯低于模型組(P<0.05)。

表2 安替可對各組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α相對表達值的影響(%)

注：與模型組比較，*P<0.05

討 論

腫瘤的新生血管生成在惡性腫瘤的生長、浸潤及轉移等過程中均起到關鍵性作用，故抗血管生成的治療方法已成為癌癥治療的一個重要手段[7]。VEGF可通過與血管內皮細胞表面受體特異性結合，而產生一系列促進內皮細胞增殖及促進新生血管形成等作用[8]。VEGFR-2則可刺激內皮細胞的增殖作用，從而產生促新生血管生成作用[9]。HIF-1α能夠有效刺激腫瘤細胞合成并分泌VEGF，從而發揮促血管功能[10]。而ADAMTS1則能夠抑制腫瘤新生血管增長，從而抑制腫瘤的進一步侵襲與轉移[11]。由此可見，VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α均是腫瘤新生血管生成作用中的關鍵蛋白。

索拉非尼可通過有效抑制腫瘤組織形成新生血管，故本研究采用該藥物作為陽性藥[12]。安替可膠囊主要由當歸及蟾皮等藥材所組成，常用于胃癌等消化系統惡性腫瘤的治療[13]?，F代醫學研究表明，該藥物中當歸多糖可有效抑制VEGF及VEGFR-2活性，而蟾皮的主要成分三羥丙基蝶日素則能夠抑制HIF-1α的表達，促進ADAMTS1的合成與分泌[14]。鑒于安替可膠囊具有較好的抗肺癌及抗血管生成作用的物質基礎，本研究檢測了其對荷瘤小鼠血管生成作用的影響，期望為該藥物的應用提供一定的實驗依據。

在本研究中，高及低劑量組腫瘤體積及腫瘤重量均明顯低于模型組，且腫瘤組織中均可見不同程度的癌細胞出現壞死與凋亡，提示安替可能夠有效抑制小鼠腫瘤組織的增長。此外，陽性藥組、高及低劑量組VEGF、VEGFR-2、ADAMTS1及HIF-1α蛋白的表達水平均明顯低于模型組，提示安替可膠囊具有較好的抗血管生成作用。然而本研究仍存在對藥物的量效關系及具體作用機制探討不清楚等問題，后期還需進一步完善。

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