黃芩素對肝癌細胞HepG2放療增敏作用的機制研究*

安 鵬，李星瑤，蔡子墨，黨慧敏，吳喜利

西安交通大學第二附屬醫院( 西安 710004)

原發性肝癌年病死率也已經占到了我國腫瘤病死率的第二位。隨著放療技術發展，其己逐漸成為治療肝癌的主要非手術方法之一[1-2]。黃芩是傳統中藥，其具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效。用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫瘡毒，胎動不安[3-4]。黃芩素是黃芩的主要提取物之一，研究表明黃芩素在體外抗腫瘤作用方面表現出活性，并且具有對常用抗癌藥物的體外增效作用[5-6]。目前，國內外尚未有關于黃芩素體外放療增敏的相關研究[7]。因此我們擬在體外進行黃芩素對肝癌細胞HepG2放療增敏的實驗研究，以探討黃芩素在放療增敏中的作用機制，從而為臨床肝癌放療增敏提供新的策略。

材料與方法

1 材 料 本組研究中人肝癌HepG2細胞株購買自ATCC細胞庫，黃芩素購買自曼斯特有限公司，純度大于99%，絲裂酶原購買自浙江海正藥業，新生胎牛血清及DMEM購買自GIBCO公司，MTT、碘化丙啶及二甲基亞砜購買自Sigma公司，RT-PCR試劑盒購買自福麥斯有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養及分組：快速將所凍存細胞于37 ℃水浴搖床60轉/min慢搖復蘇，復蘇后800轉/min離心5 min，吸去上清加入10 ml含15%胎牛血清DMEM培養基，混勻后加入細胞培養板，每孔1 ml，共10孔，5% CO2溫箱37 ℃培養。將所有細胞分為五組，即空白對照組：細胞+培養基、放療組：細胞+培養基+放療、藥物組：藥物+細胞+培養基、藥物加放療組：藥物+細胞+培養基+放療、肝細胞加藥物組：肝細胞+藥物+培養基，用MTT法實驗觀察黃芩素對細胞的生長抑制及殺傷作用，并檢測各組細胞克隆形成數及克隆形成率。

2.2 Western Blotting法：各組細胞以細胞裂解液處理后，在冰上裂解靜置30 min，后以BCA法測定蛋白質濃度。后行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再100 V濕轉90 min，并將蛋白轉移至PVDF膜上。以5% BSA封閉1 h，抗p53或β-actin抗體4℃孵育過夜，后用標記二抗孵育1 h，后使用天能凝膠成像系統檢測蛋白水平。

2.3 QRT-PCR檢測p53mRNA表達：通過SYBR熒光實時定量PCR法檢測，觀察不同組別HepG2細胞中p53mRNA表達情況，基因表達的相對定量基于比較CT (threshold cycle)值法，mRNA相對表達量結果以相對熒光值表示。PCR反應體系為20 μl，包含Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 2 μl； ddH2O 6 μl。反應條件：95 ℃預變性10 min， 1個循環， 95 ℃、變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，共45個循環。每個樣本的RNA含量均根據各自的β-actin含量進行標準化。

2.4 流式細胞術：通過FCM檢測實驗，使用AnnexinV-FITC及PI染色雙染分析各組細胞凋亡率。

2.5 統計學方法：本組研究中使用SPSS 19.0存儲并處理原始數據，使用均值±標準差及百分率表示計量及計數資料，使用方差分析及卡方檢驗分析組間數據差異，若P<0.05則認為差異存在統計學意義。

結 果

1 MTT法檢測結果 見表1。本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞存活率顯著低于其他組(P<0.05)。

表1 MTT法檢測結果

2 細胞克隆形成 見表2。本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞克隆形成數及克隆形成率顯著低于其他組(P<0.05)，但仍顯著高于肝細胞加藥物組(P<0.05)。

3 蛋白表達水平 本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞p-53/β-actin蛋白水平顯著高于其他組，見圖1。

表2 細胞克隆形成結果

4 mRNA表達水平 本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞p-53/β-actin mRNA水平顯著高于其他組， 見圖2。

圖1 Western Blotting檢測結果

5 細胞凋亡檢測結果 本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞凋亡率顯著高于其他組，見圖3。

圖2 mRNA水平檢測結果

討 論

全球每年新發原發性肝癌約26萬例，而我國的原發性肝癌占42.5%。每年因肝癌死亡的人數約占全球的45%[8]。外科手術依然是早期肝癌治療的首選，但臨床就診患者多屬中晚期病人，手術切除率低。即使早期切除，術后5 年復發率也在60%以上。隨著放療技術的發展，放射治療己成為治療肝癌的主要非手術方法[9-10]。p53是重要的抑制腫瘤基因一直備受關注，而生理性誘導產生P53依然是在缺氧環境下，有國外學者認為，缺氧環境下可以產生不同的P53，分別是突變型P53和野生型P53兩種，這兩種P53進而在細胞凋亡及血管生長過程中發揮重要作用[11]。體外培養細胞與整體動物細胞在相同的低氧環境下，體外培養細胞中突變型P53較整體動物細胞能夠促進組織血管的生長，并且更迅速地占據主導作用[12-13]。

本組研究結果顯示，藥物加放療組HepG2細胞存活率、細胞克隆形成數及克隆形成率顯著低于其他組，且藥物加放療組HepG2細胞凋亡率顯著高于其他組，HepG2細胞p-53/β-actin蛋白及mRNA水平顯著高于其他組。現代藥理實驗證實黃芩具有抗炎、抗病毒、鎮靜、抗凝血、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用。黃芩素是一種黃酮類化合物，是唇形科植物黃芩中提取、分離出來的主要有效成分之一，祖國醫學認識黃芩具有清熱解毒、止血安胎的作用，現代藥理學也發現黃芩素具有利膽保肝、抗菌抗炎及抗腫瘤的作用。尤其對抗腫瘤的作用機制缺乏更加深入的研究[14]。有研究發現，黃芩素、黃芩苷在體外實驗中對抑制肝癌細胞侵襲及轉移都有顯著的作用，其機制可能與黃芩素及黃芩苷影響Rho家族基因的表達有關[15]。有實驗表明人白血病HL-60細胞通過使用小劑量黃芩素可使其停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芩素可誘導人白血病HL-60細胞凋亡[16]。另有實驗研究發現，黃芩的水提取物可明顯改善小鼠全身性缺氧和心肌缺氧狀態，

綜上所述，黃芩素一方面在抗腫瘤方面的作用確切，另一方面黃芩具有改善組織缺氧乏氧的作用。那么是否可以通過黃芩改善腫瘤乏氧環境的方式達到腫瘤放療增敏的作用。根據實驗結果表明黃芩素可有效提高肝癌細胞HepG2放療增敏作用，改善HepG2中p53蛋白及mRNA水平，但其具體機制有待于后續深入研究。

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