四引物法快速檢測白細胞介素1A基因3'UTR插入/缺失多態(tài)性

賈二娟 ，吳夢怡 ，柴麗娜 ，余樂涵 ，萬福生 ，朱偉鋒

(1、許昌市中心醫(yī)院檢驗科，河南 許昌 461000；2、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；3、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)部，江西 南昌330006；4、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

作為IL-1家族的一個重要成員，白細胞介素1A（interleukin-1A，IL-1A）在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮著十分重要的作用。位于IL-1A基因3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的“TTCA”四堿基插入/缺失 （insertion/deletion，Ins/Del） 多態(tài)性（rs3783553） 可影響 IL-1A mRNA 和蛋白表達[1，2]，從而可能與肝癌[1]、鼻咽癌[2]、口咽癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]、卵巢上皮癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[7]、宮頸癌[8]、腦膠質(zhì)瘤[9]、斑禿[10]、骨關(guān)節(jié)炎[11]等的發(fā)病相關(guān)。目前該位點的檢測方法中，有的操作較復(fù)雜，有的成本較高，所需時間較長，因此有必要建立一種快速、簡便、低成本的rs3783553檢測方法。

四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng) （tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，T-ARMS-PCR） 是在等位基因特異性PCR基礎(chǔ)上建立起來的一種單核苷酸 多 態(tài) 性 （single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型方法[12]。T-ARMS-PCR對SNPs的分型只需要四條普通引物，PCR擴增后直接進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳時條帶出現(xiàn)的位置即可判斷基因型，已被廣泛用于SNPs和突變的研究[13-16]。目前還沒有T-ARMS-PCR法對rs3783553檢測的報道。因此，如果針對rs3783553設(shè)計四條引物，可能會實現(xiàn)該多態(tài)性位點的快速、簡便、低成本檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象 100例血樣由在許昌市中心醫(yī)院體檢的100名志愿者（均知情同意，其中男性59名，年齡27～65歲，女性41名，年齡27～70歲）提供。每位志愿者抽取靜脈血2ml，EDTA抗凝。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 使用天根全血DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA[17]。根據(jù)超微量紫外分光光度計定量結(jié)果，取部分DNA稀釋為10ng/μl，作為PCR擴增模板。

1.2.2 PCR擴增 使用T-ARMS-PCR引物設(shè)計軟件 （http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html） 設(shè) 計rs3783553分型的四條引物，上游外引物：5'-GCAG ACAGTGTTTTCTGGGATAAGTAAG-3'，下游外引物：5'-TGGTCTGATCACAATTTTTAGAACCTAGA-3'，缺失型內(nèi)引物：5'-CTGGGCATTCTTGTTTCAAT TTCA-3'，插入型內(nèi)引物：5'-ACTTGATTGCAGGTG GAATTGACTG-3'。其中上游外引物與下游外引物配對可得到352bp的共有PCR產(chǎn)物，上游外引物與插入型內(nèi)引物配對可得到插入型等位基因?qū)?yīng)的236bp的PCR產(chǎn)物，缺失型內(nèi)引物與下游外引物配對可得到缺失型等位基因?qū)?yīng)的157bp的PCR產(chǎn)物。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。 PCR 反應(yīng)體系為 10μl， 包含 5μl 2×Taq master mix（上海近岸科技有限公司），10μmol/L 上下游引物各0.2μl，10μmol/L缺失型內(nèi)引物和非缺失型內(nèi)引物各 0.6μl，模板 1.0μl，ddH2O 2.4μl。 使用朗基MG96G PCR儀進行擴增。PCR條件：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR完成后取PCR產(chǎn)物4μl在2%瓊脂糖凝膠上（含溴化乙錠0.5ug/ml）電泳，150V 30min后凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 DNA測序 隨機選取10例在瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為不同帶型的樣本擴增后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。PCR反應(yīng)體系為20μl，包含 10μl 2×Taq master mix，10μmol/L 上下游引物各 0.4μl，模板 1.0μl，ddH2O 8.2μl。PCR 條件：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

2 結(jié)果

2.1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 圖1為6例樣本rs3783553的T-ARMS-PCR分型電泳圖。從圖中可知，rs3783553的T-ARMS-PCR產(chǎn)物有3種情況：出現(xiàn)236bp和352bp的Ins/Ins基因型，出現(xiàn)157bp和352bp的Del/Del基因型，出現(xiàn)157bp、236bp和352bp的Ins/Del基因型。100例樣本中Del/Del基因型39例，Ins/Ins基因型10例，Ins/Del基因型51例。

圖1 rs3783553的T-ARMS-PCR分型電泳圖

2.2 DNA測序結(jié)果 DNA測序結(jié)果（圖2）顯示在瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為236bp和352bp的都是rs3783553的Ins/Ins基因型（圖2-A），在瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為157bp和352bp的都是rs3783553的Del/Del基因型（圖2-B），在瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)為 157bp、236bp和 352bp的都是 rs3783553的Ins/Del基因型 （圖2-C），與T-ARMS-PCR法對rs3783553的分型結(jié)果完全一致。

圖2 rs3783553不同基因型樣品測序圖

3 討論

研究表明，IL-1A基因是miR-122的靶基因之一。IL-1A基因3'UTR區(qū)DNA序列可顯著影響miR-122與其的結(jié)合。rs3783553的Ins等位基因破壞了miR-122與IL-1A的結(jié)合，從而增加了IL-1A的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[1]。Meta分析也認為該多態(tài)性與我國漢族人口癌癥易感性相關(guān)，其中Ins等位基因可能是中國漢族人群的保護因素，而Del等位基因則可能是癌癥易感因素[18]。也有研究認為該多態(tài)性還與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)[19]。

就rs3783553的檢測方法來說，目前主要有聚合酶鏈反應(yīng)-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polymerase chain reaction-polyacrylamide gel electrphoresis，PCR-PAGE）法[1-10]、DNA 直接測序法[11]、TaqMan 探針法[20]等。PCR-PAGE是目前rs3783553檢測最常用的方法，其最大的優(yōu)點是一次可對較多樣本進行檢測，成本較低。但該方法需要配制聚丙烯酰胺凝膠，電泳結(jié)束后還需要染色、漂洗、顯色等步驟，操作較復(fù)雜。DNA直接測序法是檢測DNA序列的金標準，但需要昂貴的設(shè)備，成本較高。TaqMan探針法能夠簡便的對rs3783553進行檢測，但引物需要修飾，因此成本較高。此外也需要用到昂貴的設(shè)備。

從圖 1可知，Ins/Del基因型的 157bp、236bp的特異性片段的亮度相當(dāng)，表明PCR的體系合適。Ins/Ins基因型的352bp共有片段很弱，可能是因為插入型內(nèi)引物與上游外引物的結(jié)合影響了上游外引物和下游外引物的結(jié)合。Ins/Del基因型的352bp片段較Del/Del基因型的352bp稍弱也說明了這一點。本研究中三種基因型的分布與北京[1]、江蘇[1]、大連[11]等正常人群中基因型的分布接近和DNA測序與T-ARMS-PCR法的分型結(jié)果完全一致都證明了本方法的可靠性。Delvaux等用T-ARMSPCR、PCR-RFLP、TaqMan探針和DNA直接測序的方法對IL-28B基因上的兩個SNPs進行了分析，結(jié)果表明T-ARMS-PCR方法的成本效益比最好，而且快速、簡便，不需要特殊的設(shè)備，適合在發(fā)展中國家使用[15]。

總的來說，本研究建立的四引物檢測IL-1A基因3'UTR插入/缺失多態(tài)性的方法，是一種能在普通實驗室開展的操作簡便、快速、低成本的檢測方法。

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