優(yōu)化冰凍血小板制備條件的初步研究

孫瑜，翁美芝，熊莉，徐翠玲，付文霞，袁蝦，樊立榮，吳紅，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌 330000)

對因血小板缺失導致的出血性疾病，輸注血小板是特異性的治療方法[1-4]，但應急情況下新鮮血小板來源不足，且保存條件有利于細菌生長，直接限制了臨床應用。為更好的滿足臨床需求，各國均在研究延長血小板保存期限的方法，我國1989年便有文獻[5]報導應用DMSO保存濃縮血小板。但冰凍血小板的制備操作過程嚴格，貯存條件高，解凍后血小板容易出現(xiàn)絮狀物，影響質量，甚至報廢，為提高冰凍血小板的保存質量，保護受血者利益，我中心根據(jù)相關文獻嘗試使用不同濃度的二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO），選擇不同條件制備冰凍血小板，并選擇不同溫度融化冰凍血小板，以期尋找出最適合制備冰凍血小板的方法。現(xiàn)匯報如下：

1 材料與方法

1.1 獻血者選擇 隨機選擇我中心無償獻血者，年齡（18~47周歲），男18例，女30例，遵循知情同意原則抽取本人全血400ml，制備手工血小板。

1.2 儀器與設備 赫立氏6000i離心機 （美國熱電公司），血小板振蕩儀（蘇州醫(yī)用儀器廠），-80℃深低溫冰箱，（三洋），速凍機（多美達），循環(huán)水浴箱（濰坊普華），全自動血細胞計數(shù)儀（希森美康）

1.3 試劑 DMSO（Lot：USP4F1S，德國 WAK），生理鹽水（Lot：160302 31A，上海輸血技術有限公司）

1.4 方法

1.4.1 手工血小板的制備 使用富漿法制備手工血小板，離心程序為 1200g×9min，22℃；3000g×4min，22℃，保留60g終產(chǎn)品置于血小板保存袋中，并將每袋血小板以無菌接管機分成20gX2袋，余下的作為濃縮血小板對照組，均置于血小板振蕩儀中振蕩保存；

1.4.2 75%DMSO的配制 由DMSO原液與0.9%NaCl以3：1的體積比在無菌條件下配制，配好后置于-50℃冰箱保存，使用前取出，無須室溫平衡。

1.4.3 冰凍血小板的制備

1.4.3.1 使用DMSO原液制備冰凍血小板 在百級無菌室內，以加藥件按1ml/min的速度緩慢將DMSO原液加入血小板懸液深部，邊加邊振（頻率60次/min），充分混勻，使終濃度為5%，振蕩8min后-80℃冰凍保存；

1.4.3.2 使用75%DMSO制備冰凍血小板：按公式“血小板凈重(g)×0.071”計算，即得終產(chǎn)品內DMSO達5%濃度所需的75%DMSO體積，用前取出75%DMSO，以注射器直接加入血小板袋內，邊加邊振（頻率無要求），直接搖均，使之終濃度為5%，迅速置-80℃保存；

1.4.4 冰凍血小板的融化 從-80℃深低溫冰箱中取出冰凍血小板，迅速置于38℃水浴或或流動自來水中融化。

1.4.5 實驗分組 將48例獻血者制備的共96袋冰凍血小板隨機分成2組，每組24例48袋，每組均按冰凍液與融化條件中固定其一的原則，共分4大組；組1與組2為配對組，使用同一人的冰凍血小板；組3與組4為配對組，使用同一人的冰凍血小板，詳見表1。

表1 冰凍血小板實驗分組（n=96）

1.5統(tǒng)計學方法 使用excel2007[6-8]進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標準差（x±s）表示；計量資料的統(tǒng)計分析選擇t檢驗，以配對t檢驗行兩兩配對組比較；計數(shù)資料統(tǒng)計分析選擇χ2檢驗。

2 結果

2.1 冰凍前、解凍后血小板的質量檢測均合格，冰凍保存過程中各項指標檢測達到質量標準。

2.2 血小板回收率 （%Recovery)(復蘇后血小板計數(shù)/冰凍前血小板計數(shù))，血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)的比較見表2。

表2 濃縮血小板冰凍前、后血小板回收率、MPV、PDW的比較（x±s）

2.3 絮狀物的出現(xiàn)

2.3.1 本實驗中，流動自來水融解時有1袋（1/48）出現(xiàn)絮狀物（χ2=9.5174，P＞0.05）。

2.3.2 本中心制備的冰凍單采血小板中出現(xiàn)絮狀物的概率見表3。

表3 不同濃度的DMSO對冰凍單采血小板復蘇后絮狀物的影響

3 討論

DMSO作為低溫保護劑有許多優(yōu)點[9]，如可靜脈輸注，安全劑量0.92g/kg體重，制備的冰凍血小板無需洗滌，復溫后可直接輸注[10]，該試劑已廣泛應用于干細胞保存中。在冰凍血小板的使用上，5%的DMSO的終濃度在安全劑量范圍內，但目前，冰凍血小板尚未大量使用[11]，國內《全血與成分血質量要求》（GB18469-2012）中也未提出該產(chǎn)品的具體質控指標，如何通過大量數(shù)據(jù)的積累，使冰凍血小板的質量規(guī)范盡早出臺，緩解我國因人數(shù)巨大而導致的血小板的臨床供需矛盾已成為血站成分制備的一個研究熱點。

本次實驗沒有以血小板直接計數(shù)來判斷冰凍效果，而是選擇了復蘇后血小板的回收率作為衡量指標，因本實驗隨機選擇無償獻血者作為實驗對象，而非單采獻血者，對其制備后的血小板含量無明確要求，血小板回收率更能反映制備效果，且更有可比性。

隨機分組冰凍血小板，濃縮血小板冰凍前、后血小板回收率、MPV、PDW的比較均顯示兩個對照組的差異有統(tǒng)計學意義，有趣的是，四個組與冰凍前相比，其差異也有統(tǒng)計學意義，所以無法據(jù)此判斷到底哪一種方法更為理想。但根據(jù)許多文獻[12，13]顯示，冰凍血小板復蘇后，至少血小板回收率的指標在冰凍前與解凍后均無顯著性差異，我們的實驗結果可能由以下原因導致：一、樣本量過小；二、48袋血小板的濃縮、分袋、冰凍與解凍由若干工作人員完成，手法有差異；三、濃縮血小板的紅細胞混入量高于單采血小板，在制備冰凍解凍血小板時對計數(shù)有影響。僅就本次實驗中的血小板回收率的均數(shù)與標準差而言，75%DMSO制備的冰凍血小板回收率較好，但也僅在85%左右徘徊，這符合國外學者認為的凍存與解凍過程中，一般有15%-40%的血小板損失的結論[14]。

冷凍血小板融解后出現(xiàn)絮狀物一般有兩大因素：⑴纖維蛋白析出和血小板損傷[15]。⑵DMSO注入過快產(chǎn)生高熱量，灼傷血漿蛋白，導致絮狀物析出。但是，75%的DMSO制備后置入-50℃的冰箱內保存，在制備冰凍血小板需加樣方取出，該溫度可有效平衡DMSO的水合放熱，避免血漿蛋白的變性與血小板的激活，有效防止絮狀物的產(chǎn)生。結合本次實驗的絮狀物出現(xiàn)的絕對值和統(tǒng)計分析情況，75%的DMSO制備的冰凍血小板與38℃水浴復蘇冰凍血小板絮狀物的產(chǎn)生更少。因此，75%的DMSO更適合制備的冰凍血小板。

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