人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離與活性關系的研究

董桂香，王愛國，王雷鳴

(鄭州市骨科醫院，河南 鄭州 450052)

肌酸激酶是人體生物體內能量代謝的關鍵酶，在生物體內一些關鍵耗能的細胞和組織中均存在分布，肌酸激酶的四種同工酶主要以二聚體形式存在，且腦型肌酸激酶在許多疾病診斷中得到廣泛使用[1，2]。人體基因組中由于單個核苷酸發生變化，導致DNA序列產生多樣性，臨床將其稱為單核苷酸多態性（SNP）[3，4]。 SNP 在人體中含量相對較高，并且分布較廣，具有一定的遺傳性，并且其表達水平與人腦肌酸激酶活性有關，能在一定程度上影響人腦型肌酸激酶結構、功能等，誘導期能力代謝異常[5，6]。本研究旨在探討人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離與活性的關系，現將研究結果簡要報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年12月-2016年12月醫院采集有人腦部組織的患者50例，男28例，女22 例，年齡 38～62 歲，平均（45.64±4.53）歲。疾病類型：24例腦梗死，16例腦出血，10例顱腦外傷。入選患者均符合1996年全國第四屆腦血管病學術會議中關于腦血管疾病臨床診斷標準[7]，均經過生化指標、頭顱CT檢查或MRI得到確診。不同患者性別、年齡、疾病類型比較差異無統計學意義。

1.2 方法 ⑴測定原理。采用pH-比色法測定標本組織中肌酸激酶的活性，并對肌酸激酶的底物進行反應動力學試驗。肌酸激酶在催化正向反應時會隨著ATP向肌酸上轉移磷?；耐瑫r產生相同摩爾的氫離子，其最適宜的pH為7.5～9.0，屬于一個寬闊的平臺狀。在該范圍內測定氫離子的生成速度可以作為酶活力的測定指標。⑵腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離：取獲得的人腦部組織，加入5mmol/L乙醇，保證溶液PH值為7.5，加入50mmol/L Tris-HCL液支撐勻漿，15min離心，速度為31000r/min，去除沉淀，獲得上層清液I；在磁力攪拌下緩慢加入預冷的濃度為95.0%乙醇，保證溶液溶度為50.0%，繼續攪拌30min，15min離心，獲得上層清液Ⅱ。再加入乙醇提高藥物濃度為70.0%，15min離心，速度為3400r/min，去除上層清液Ⅲ，將獲得的沉淀中加入Tris攪拌后均勻，15min離心，速度為31000r/min，獲得上層清液Ⅳ，Tris透析1h后行Q-Sephsrose HP柱層析，控制流速為0.7ml/min。樣品上柱后，利用Tris洗滌，然后再用含0-500mmol/L NaCl的Tris液進行梯度洗脫，分別合并CK-BB和NSE峰值管，放置在Tris液中進行24h透析，-80℃下貯存，完成腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離。由SDS-PAGE與native-PAGE檢測均為一條帶。⑶檢測方法。采用280nm光吸收完成酶濃度的監測，人腦部組織消光系數為8.8。根據文獻[8]方法進行，測定體系中含有底物肌酸與ATP及鎂離子，利用百里酚藍作為pH指示劑，利用pH比色法測定酶的活性[9，10]。結締組織與神經組織后加入150ml濃度為0.01mol/L的KCl，利用組織打碎機、高速分散器進行3次粉碎，每次不超過30s，冰浴下離心15min，速度為8000r/min，取沉淀進行干燥，最終獲得人腦型肌酸激酶樣品。取樣作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，測量其亞基分子量，檢測其是否達到電泳一條帶的純度，再次取樣采用凝膠層析法測量該酶的分子量[11，12]。

1.3 統計分析 采用SPSS 18.0軟件處理，計數資料行x檢驗，采用n（%）表示，計量資料行t檢驗，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對于酶的抑制反應是不可逆的反應。從圖1中可以看出產物濃度的對數與時間的變化為線性關系。通過曲線的斜率與抑制劑的濃度結果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關關系，見圖1。

圖1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析（圖中1、2、3、4、5表示連續測定的5個數據點）。

2.2 不同氨基酸位點對人腦型肌酸激酶活性的影響 本課題研究了26、36、59級267位氨基酸發生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩定性的關系，結果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發生解離，二體的解離與酶功能喪失成正相關性。由于空間排阻效應影響二體形成蛋白質的折疊途徑，導致SNP突變及動力學差異顯著（P<0.05），見表 1。

表1 不同氨基酸位點對人腦型肌酸激酶活性的影響

3 討論

肌酸激酶在人體腦部組織中含量豐富，不僅存在于星形細胞中，也存在于神經元中，如神經元軸突、樹突、子宮及甲狀腺中，但是這些組織中的肌酸激酶遠遠低于人腦組織中[13]。因此，臨床上將肌酸激酶用于臨床疾病診斷中效果理想，且診斷具有特異性[14]。通常來說，人腦型肌酸激酶水平的升高提示腦部損傷，且從功能可以分為四種：肌肉型、腦型、雜化型和線粒體型。有報道顯示[15]，細胞內約有1%的氧被用于氧化細胞內的蛋白質，并且在衰老動物細胞中氧化的蛋白質能占總蛋白質的30.0%～50.0%，并且氧化過程中伴有蛋白質的交聯、多肽鏈的斷裂、不同氨基酸的轉化以及氨基酸殘基的修飾。由此看出：人腦型肌酸激酶在人體中蛋白的合成、分解中發揮了重要的作用。本研究中，人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對于酶的抑制反應是不可逆的反應。從圖1中可以看出，產物濃度的對數與時間的變化為線性關系。通過曲線的斜率能獲得與抑制劑的濃度獲得A，結果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關關系。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在一定的相關性。同時，人腦型肌酸激酶SNP突變后將會產生可逆的氧化狀態，并且這種修飾能引起蛋白質結構的變化，并且如果得不到及時有效的控制，又會引起進一步氧化或其他類型的修飾產生[16]。

本課題研究了26、36、59級267位氨基酸發生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩定性的關系，結果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發生解離，二體的解離與酶功能喪失呈正相關性。由于空間排阻效應影響二體形成蛋白質的折疊途徑，導致SNP突變及動力學差異顯著（P<0.05）。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在明顯的相關性，通過測定人腦型肌酸激酶水平能了解患者的病情，指導臨床治療，使得患者的治療更具針對性[17]。

但是，本課題研究過程中尚存在很多不足，一方面標本在測定時存在過多的累積誤差，另一方面本研究屬于是一個全新的領域，研究過程中存在的難度相對較大，對于試驗結果的準確性及可靠性有待進一步研究和探討。綜上所述，人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性間存在一定的相關性，用于一些疾病診斷中效果理想，為臨床治療提供依據和參考。

[1]宋青山，楊江流，賈芳.海藻糖對人腦型肌酸激酶熱變性的保護作用[J].中國畜牧獸醫，2016，43（1）：157-163.

[2]孫妍妍，曲高平，黃謙心，等.甘藍型油菜抗苯磺隆突變體ALS基因分析與 SNP標記[J].中國油料作物學報，2015，37（5）：589-595.

[3]孔慶輝，晁燕，夏明哲，等.黃河裸裂尻魚肌酸激酶M-CKcDNA的克隆及組織表達分析[J].動物學雜志，2016，51（1）：84-94.

[4]肖雄，董占飛，古力努爾·哈布哈吉力，等.分化型甲狀腺癌患者術后停藥隨訪期間肌酸激酶水平升高的影響因素研究[J].中國全科醫學，2016，19（23）：2789-2793.

[5]呂和平，倪海真，黃景勇，等.肌酸激酶及CT血管造影檢查評估腸系膜上動脈栓塞的短期預后[J].中華消化外科雜志，2016，15（8）：840-844.

[6]王國慶.大鼠運動性骨骼肌損傷后血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶以及波形蛋白的變化 [J].中國老年學雜志，2016，36（15）：3634-3636.

[7]楊小二，俞菁，胡荷宇，等.肌酸磷酸激酶檢測聯合分子診斷技術篩查新生兒杜氏肌營養不良癥[J].中華檢驗醫學雜志，2015，38（1）：32-34.

[8]李穎娜，宋翔，吳芳，等.肌酸激酶與CT冠狀動脈造影下支架通暢情況的相關性 [J].中國醫學科學院學報，2015，37（2）：140-146.

[9]張春，何娟，朱崢，等.丙泊酚鎮靜致肌酸激酶升高的病例分析[J].中國藥房，2015，26（12）：1651-1653.

[10]唐慎華，賈秀紅，李建廠，等.N末端B型鈉尿肽原和肌酸激酶同工酶MB對肺炎患兒心力衰竭的診斷價值[J].臨床兒科雜志，2015，33（8）：694-697.

[11]張齡幻，于艷輝，朱曉萍.重癥肺炎合并心力衰竭患兒血清肌酸激酶同工酶、腦利鈉肽及神經肽Y水平變化[J].臨床兒科雜志，2015，33（6）：539-542.

[12]胡茂龍，龍衛華，高建芹，等．油菜抗咪唑啉酮類除草劑基因BnALS1R等位基因特異PCR標記的開發與應用[J].作物學報，2013，39（10）：1711－1719．

[13]Hu ML，Pu HM，Kong LN，et al．Molecular characterization and detection of a spontaneous mutation conferring imidazolinone resistance in rapeseed and its application in hybrid rapeseed production[J].Mol Breeding，2015，35（31）：1-13．

[14]Li HT，Li JJ，Zhao B，et al．Generation and characterization of tribenuron-methyl herbicide-resistant rapeseed（Brasscia napus）for hybrid seed production using chemically induced male sterility[J].Theor Appl Genet，2015，128（1）：107-118．

[15]Ghio C，Ramos ML，Altieri E，et al．Molecular characterization of ALS1，an acetohydroxyacid synthase mutation conferring resistance to sulfonylurea herbicides in soybean [J].Theor Appl Genet，2013，126（38）：2957-2968．

[16]劉首明，夏慧，江小萍，等.急性心肌梗死患者心型脂肪酸結合蛋白水平檢測及臨床價值 [J].實驗與檢驗醫學，2015，33（5）：673-675.

[17]胡娟玉，李禮.心型脂肪酸結合蛋白與肌紅蛋白聯合檢測在急性心肌梗死早期診斷中的價值 [J].實驗與檢驗醫學，2014，32（3）：297-306.