偏頭痛的五羥色胺1A受體(5-HTR1A)基因-1018C/G啟動子區(qū)多態(tài)性位點分析

許賢平，易飛

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 萍鄉(xiāng)337000)

偏頭痛屬于神經(jīng)內(nèi)科常見病，是臨床上發(fā)病率較高的一種血管性頭痛，該病具有病程長、易復(fù)發(fā)等特點，對患者健康及生活質(zhì)量的影響極大。臨床上通常將偏頭痛分為先兆性與無先兆性偏頭痛兩種?，F(xiàn)階段臨床上尚未明確該病發(fā)生的主要因素，通常認為其和遺傳及環(huán)境等多種因素有關(guān)，部分學(xué)者認為多個微效基因聯(lián)合作用構(gòu)成了其遺傳易感性[1]?，F(xiàn)階段臨床上尚未發(fā)現(xiàn)偏頭痛的致病基因，僅可見部分易感基因。五羥色胺（5-HT)及其受體和偏頭痛有較大關(guān)聯(lián)。5-HTR1A基因存在5q11.2-q13區(qū)，其中基本無內(nèi)含子。隨著研究的深入，臨床上在啟動子區(qū)檢測到該基因-1018C/G多態(tài)性位點，具有較多的遺傳信息[2]。為了解偏頭痛的基因多態(tài)性位點情況，本研究對收治的156例偏頭痛患者及138例健康對照組人員進行了對比分析，詳細報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 選取2014年1月到12月期間在江西萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院就診的156例偏頭痛患者，所有患者均為漢族，患者均符合相關(guān)診斷標準[3]，其中男68例，女88例；患者年齡最小17歲，最大59歲，平均年齡（36.98±12.54）歲；

1.1.2 正常對照組 選取同期在我院進行健康體檢的138例健康體檢者為對照組，其中48例為男性，90例為女性，年齡最小18歲，最大55歲，平均（35.29±11.47）歲，病例組與對照組患者臨床資料無較大差異（P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 所有患者均采集靜脈血5ml，同時進行抗凝處理，然后提取DNA，提取方法均采用常規(guī)酚/氯仿抽提法，標本采集后30min內(nèi)紅細胞破膜，取肝素抗凝外周血5ml裝入50ml離心管中，加3倍體積的紅細胞裂解液混勻，在4℃環(huán)境下靜置30min。在溶液透明后3000r/min離心10min，去除清液在沉淀中加入2ml的細胞核裂解液，混合均勻之后加入200μl濃度為20%的SDS，在粘稠透明后加入20μl濃度為20mg/ml的蛋白酶K，在37℃恒溫搖床消化過夜。次日依次加等體積的Tris飽和酚，以3000r/min下離心處理10min后，加入等體積三氯甲烷，以3000r/min下離心處理10min后，將上部清液轉(zhuǎn)移到另一個15ml的無菌離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，搖勻后可見白色絮狀DNA析出。

1.2.2 PCR擴增 位點分析以聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)計數(shù)為主，PCR反應(yīng)體系為20ul中含100ngDNA，上游引物為5，-TGG AAGAAGACCGAGTGTCTAC-3，下游引物 5，-TCT CCCTGGGAGAGTAAGGCTGG-3，上下游引物各0.5uM，dNTPs 200uM，MgCl21.5mM，1×PCR buffer溶液及0.5u的TapDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為：95℃變性 5min； 然后以 95℃變性 45s，56℃復(fù)性45s，72℃延伸 45s，循環(huán)反應(yīng) 35次；最后 72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物為182bp的DNA片段，取10ul PCR產(chǎn)物加4u HpyCH4Ⅳ內(nèi)切酶，于37℃條件下進行酶切6h，2%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色，最后鑒定基因型。

1.2.3 擴增條帶檢測 由于-1018C→G單堿基置換使HpyCH4Ⅳ限制性位點消失，故消化產(chǎn)物出現(xiàn)182bp則表明攜帶突變型-1018G，出現(xiàn)158bp、24bp則表明攜帶野生型-1018C。由于實際電泳時24bp條帶難以顯示，出現(xiàn)182bp一條帶代表GG基因型，出現(xiàn)182bp、158bp兩條帶代表CG基因型，出現(xiàn)158bp一條帶代表CC基因型。

圖1 5-HTR1A基因-1018C/G位點PCR產(chǎn)物酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖

1.2.4 統(tǒng)計方法 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件研究，計數(shù)資料組間差異檢驗進行卡方檢驗，并進行Hardy-Weinberg平衡分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 病例組患者χ2=0.398，df=2，P=0.819， 對照組則分別為 0.090、1、0.956，兩組5-HTR1A基因-1018C/G位點的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明兩組患者樣本基因型均可獨立表達總體。

2.2 基因頻率分布 (表1)對比兩組等位基因頻率無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.028，df=1，P=0.868)。

表1 5-HTR1A基因-1018C/G多態(tài)性等位基因與基因型分布

3 討論

偏頭痛是臨床上發(fā)病率較高的一種原發(fā)性頭痛類型，該病患者的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)作性中重度、搏動樣頭痛為主，疼痛時間通?？沙掷m(xù)4-72h，部分患者可見惡心、嘔吐等癥狀，對患者健康的影響極大[4，5]。由于偏頭痛較為復(fù)雜，這也就加大了致病基因檢測的難度。候選基因關(guān)聯(lián)分析是臨床上較為常用的一種遺傳研究方式，其主要是將單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為一串標記，對疾病和標記間的關(guān)聯(lián)進行研究，進而達到篩選易感基因效果的一種方式[6，7]。隨著研究的深入，臨床上通常認為偏頭痛的易感性研究候選基因為5-HT受體基因[8]。國外研究顯示5-HT 1A轉(zhuǎn)運體基因可導(dǎo)致疾病易感性加大，并認為其和偏頭痛的發(fā)生有較大關(guān)聯(lián)[9，10]。

Kusumi在117例日本偏頭痛和360例對照者中對5-HTR2C基因23號外顯子多態(tài)位點cys23ser進行分析，發(fā)現(xiàn)ser等位基因頻率較對照組高，提示cys23ser增加日本群體的疾病易感性[11]。-1018C/G是5-HTR1A基因啟動子區(qū)的SNP，可影響基因的轉(zhuǎn)錄和受體的表達，可作為偏頭痛易感基因的篩選位點[12，13]。

我們通過對156例偏頭痛患者和138例對照者進行PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，5-HTR1A基因–1018C/G多態(tài)性位點等位基因和基因型頻率在兩組中分布無明顯差異，與Ates研究者在土耳其人群中，對比分析203例偏頭疼患者和202例對照者中基因多態(tài)性位點分析結(jié)論一致[12]。5-HTR1A基因-1018G等位基因頻率在漢族群體中為22.5%，而西班牙人為53.5%，不同種族間存在有較為明顯的不同，這說明該位點具有一定的種族特異性，故而必須要在其他人群中展開更加深入的研究[7]。有研究顯示，MO患者中具有5-HT1A受體的超敏感性，預(yù)防偏頭痛的藥物可經(jīng)由5-HT1A受體起到一定的預(yù)防功效，這就表明，該受體與偏頭痛的發(fā)生有較大關(guān)聯(lián)[14，15]。

總而言之，雖然1018C/G位點可在一定程度上對5-HTR1A基因的轉(zhuǎn)錄造成影響，但其并不表明5-HTR1A基因-1018C/G是導(dǎo)致偏頭痛發(fā)生的主要危險因素，臨床上仍需加大研究力度，開展更加深入的探究。

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