牛板筋中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測研究

賈冰凝

摘 要：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌，對食品安全和人類健康具有危險性。本文通過對牛板筋中單增李斯特菌檢測的微生物法、全自動微生物鑒定儀法和熒光PCR法這3種方法進行研究，得出結(jié)論：3種方法結(jié)果具有較高一致性，其中熒光PCR法快速、高效，在食品安全抽檢和監(jiān)測工作中值得應(yīng)用和推廣。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌 牛板筋 檢測方法 檢出率

中圖分類號：TS202 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）11（a）-0-03

單增李斯特菌是一種常見的食源性致病菌，可導(dǎo)致新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下等敏感人群發(fā)生腦膜炎、流產(chǎn)、敗血癥、死胎、胃腸炎等，嚴(yán)重?fù)p害健康，死亡率達(dá)到30%左右。食物是李斯特菌傳播的主要途徑[1]，且該菌在污染的食物中，可于低溫保藏時緩慢生長，達(dá)到引起感染所需的劑量[2]。

牛板筋是指牛背部兩塊連接全身運動肌肉的主大筋，因為它好吃，有嚼勁，所以受到很多人的喜愛，近年來大量出現(xiàn)在燒烤餐飲市場。以前各家燒烤店通常自己購進牛板筋原料，進行手工穿串，現(xiàn)場烤制。隨著夜市生活的繁榮，牛板筋的需求量逐年增大，加工過程逐漸發(fā)展成為產(chǎn)業(yè)化。由于有的生產(chǎn)企業(yè)在加工、儲存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)質(zhì)量控制不嚴(yán)格，造成供應(yīng)燒烤市場的牛板筋受到單增李斯特菌污染，加之烤制過程不能夠充分滅菌，導(dǎo)致存在較大的食品安全隱患。因此，加強對此類食品及其原料的市場抽檢監(jiān)測，預(yù)防食品安全事故發(fā)生，顯得尤為重要。

食品中單增李斯特菌的檢測方法通常有：微生物法、全自動微生物鑒定儀法和熒光PCR法3種方法，本文通過研究近幾年運用熒光PCR法的檢測實際，并與其他兩種方法的測定結(jié)果進行比較分析，找出各種方法的特點，為開展食品及其原料的市場抽檢監(jiān)測提出建議。

1 材料和方法（實驗部分）

1.1 實驗材料

近幾年委托、監(jiān)督、國抽送檢的牛板筋肉制品。

1.2 試劑與儀器

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌：單增李斯特菌ATCC19115；英諾克李斯特菌ATCC33090；伊氏李斯特菌ATCC19119；斯氏李斯特菌ATCC35967；金黃色葡萄球菌ATCC25923；馬紅球菌ATCC6939；阪崎腸桿菌ATCC25944；腸炎沙門氏菌ATCC14082；大腸埃希氏菌ATCC25922；志賀氏菌ATCC51572；銅綠假單胞菌ATCC27853均由本中心微生物實驗室保存。

（2）培養(yǎng)基和試劑；LB、PALCAM、李斯特顯色培養(yǎng)基、TSA-YE、血平板、多種微量生化鑒定管軍購自青島海博，科馬嘉李斯特顯色培養(yǎng)基購自上海申工，GP（革蘭式陽性）鑒定卡（法國生物梅里埃公司）、DNA提取試劑盒、PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司

（3）儀器設(shè)備：超低溫冰箱（松下冷鏈大連有限公司）低溫培養(yǎng)箱（德國BINDER）、VITEK2全自動微生物生化鑒定儀（法國生物梅里埃公司）、小型恒溫槽（日本HAITEC公司）、高速冷凍離心機（日本HAITEC公司）、核酸蛋白分析儀（美國熱電）、實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（德國Epperdorf公司和美國伯樂公司）。

1.3 試驗方法

（1）傳統(tǒng)微生物法。

①增菌分離；抽樣和送樣按照GB 4789.1-2010、GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》二級采樣，n=5，c=0，m=0[3]，檢測方法按照GB 4789.30-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》進行。25g樣品+225mL LB1，均質(zhì)，30℃，24h前增菌，取1mL LB1至10mL LB2中，30℃，24h后增菌，取LB2增菌液劃線PALCAM和李斯特顯色培養(yǎng)基36℃，24h+24h進行分離培養(yǎng)，若污染較嚴(yán)重，PALCAM和法國科馬嘉李斯特顯色培養(yǎng)基24h內(nèi)即可觀察[4]。

②初篩：挑取現(xiàn)色板上典型或可疑菌落接種木糖、鼠李糖，并同時劃線TSA-YE平板，36℃，18h-24h培養(yǎng)，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物進行鑒定。

③生化鑒定：染色鏡檢、動力試驗、生化鑒定、溶血試驗、協(xié)同溶血試驗均按照GB4789.30-2016執(zhí)行并結(jié)果判定。

（2）全自動微生物鑒定儀法：制備0.6左右麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海═SA-YE平板上菌落），GP鑒定卡，上機測試。結(jié)果查對VITEK2鑒定細(xì)菌目錄。

（3）實時熒光PCR法。

①模板DNA的制備（兩種）。

第一，利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。吸取1.5mL LB1增菌液至2mLEP管中，離心，棄上清液，若沉淀量少，再次吸取1.5mL LB1增菌液，離心，棄上清液，以下步驟按照產(chǎn)品說明書進行提取，核酸蛋白分析儀測定DNA含量，260/280=1.8～2.0間，且核酸濃度得量在30～50ng/μL最為合適。濃度若高，需稀釋。

第二，水煮裂解法（菌落PCR）。

取TSA-YE上菌落，制成2.0麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?，?.5mL至2.0mLEP管中，12000r/min離心5min，棄上清，加50μL滅菌ddH2O或TE溶液，旋渦震蕩混勻，置小型恒溫槽70℃加熱10min， -20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ陨喜僮骶赑2實驗室進行）。

②引物、探針的設(shè)計和合成。

根據(jù)SN/T 1870-2007《食品中致病菌檢測方法 實時PCR法》中公布的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測所用引物和探針序列[5]，委托大連寶生物工程有限公司合成。

③實時熒光PCR反應(yīng)體系。

反應(yīng)體系25μL：PCR Mix12.5μL，上游引物（10μmol）1μL，下游引物（10μmol）1μL，探針（10μmol）1μL，模板DNA（10～50ng）2μL，無菌水補至25μL。

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30s，94℃變性 5s、58.2℃延伸40s，進行40個循環(huán)。

同時設(shè)陽性、陰性及空白對照，空白對照為無菌水。結(jié)果及判斷執(zhí)行SN/T 1870-2007。

將1.2小節(jié)中（1）所列標(biāo)準(zhǔn)菌提取的基因組DNA，按照上式的反應(yīng)體系進行試驗，結(jié)果如圖1所示，只有單增李斯特氏菌為陽性，Ct：17.23，18.32，其余10種菌：英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、馬紅球菌、阪崎腸桿菌、腸炎沙門氏菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌均為陰性，說明該方法特異性較好。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

我中心自2012年開展生肉制品單增李斯特菌檢測，近幾年加大檢測范圍，餐飲食品涼拌菜、熟肉制品也增加了此項目檢測，檢出率逐年增加，尤其牛板筋中檢出率最高。見表2。（樣品數(shù)量為批次，總檢測數(shù)量為18×5，牛板筋檢出陽性數(shù)為1×5，以此類推）。2015年牛板筋檢測數(shù)量占單增李斯特菌總檢測樣品數(shù)量的27.8%，而檢出率占總陽性率11.1%中一半，即5.55%為牛板筋，如此，2016年的10.7%的2/3，即7.13%為牛板筋，2017年的12.5%的3/5，即7.5%，即相對陽性率也是增加的。

本實驗室為國家級實驗室，一般情況下試驗方法選擇為國家標(biāo)準(zhǔn)方法，即GB 4789.30-2016微生物法。3年來，對3種檢測方法得出數(shù)據(jù)進行了比對分析，一是檢測過程中將典型菌落全部進行生化鑒定的同時，進行全自動微生物鑒定儀鑒定和熒光PCR測定。二是選取部分不典型菌落進行生化鑒定、全自動微生物鑒定儀鑒定和熒光PCR測定（見表3），得出結(jié)論：3種鑒定方法結(jié)果一致，均準(zhǔn)確可信；熒光PCR與傳統(tǒng)微生物方法相比，其操作簡便、準(zhǔn)確快速、高通量、高敏感[6]，將會對食品市場抽檢監(jiān)測提供更加準(zhǔn)確、快速、高效的技術(shù)檢測服務(wù)。

從表4可以看出，熒光PCR法耗時最少，在時間上占絕對優(yōu)勢。其他方法所需的設(shè)備、設(shè)施、人力等資源條件都可以通過投入和人員引進培訓(xùn)來滿足，達(dá)到完成試驗任務(wù)的目的。而時間是有限的，不可再生，在高速發(fā)展的今天，滿足服務(wù)食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展和食品安全監(jiān)管的需求，熒光PCR法耗時少的優(yōu)勢是無可替代的。

2.2 討論

（1）由表2可以看出牛板筋檢出單增李斯特菌的陽性率相當(dāng)高，且呈逐年上升趨勢，檢出陽性菌均及時上報有關(guān)部門。

（2）生化鑒定中GB 4789.30 5.4.5規(guī)定協(xié)同溶血試驗為可選檢測項目，依據(jù)筆者多年試驗經(jīng)驗，溶血試驗有時結(jié)果不明顯。為保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，及對客戶負(fù)責(zé)的態(tài)度（剩余樣品和同批次樣品不進行微生物項目復(fù)檢[7]），溶血試驗和協(xié)同溶血試驗應(yīng)同時進行，并進行結(jié)果參照。

（3）因?qū)幭膶傥鞅鼻钒l(fā)達(dá)地區(qū)，食品生產(chǎn)加工企業(yè)數(shù)量少、規(guī)模小，有的質(zhì)量安全意識不強，質(zhì)量保證條件較差。3年來檢測的牛板筋共20批次，100個樣品，從批次上看，檢測樣品雖不具有普遍性，但仍發(fā)現(xiàn)同一生產(chǎn)廠家不同批次的產(chǎn)品受到單增李斯特菌污染，說明有的生產(chǎn)企業(yè)在加工、儲存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)質(zhì)量控制不嚴(yán)格，從而導(dǎo)致微生物污染，帶來食品安全隱患。因此，加強對此類食品及其原料的市場抽檢監(jiān)測，預(yù)防食品安全事故發(fā)生，顯得尤為重要。熒光PCR法是比較快速、高效的方法，將會對食品市場抽檢監(jiān)測提供更加有力的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1] World Health Organization. Foodborne listeriosis[R]. Geneva：WHO，1988：421-428.

[2] 陳廣全，張惠媛，曾靜，等.食品安全檢測培訓(xùn)教材 微生物檢測[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：366.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布.GB 29921-2013，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[4] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30-2016，食品微生物檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布.SN/T 1870-2007，食品中致病菌檢測實時PCR法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[6] 劉芳，徐振娜，洪偉彬，等.食品中單增李斯特菌熒光PCR檢測方法的建立[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2017（17）：92-93，99.

[7] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布.GB 4789.1-2016，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗總則[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.