酸乳發酵中優良共生酵母菌的篩選

袁鳳霞,田 莎,曹曉虹,劉建利,王軍節,張 琇,李靖宇,宋 峰,李學斌,覃璐琪,鄧鵬程,王曉丹

(北方民族大學生物科學與工程學院；發酵釀造工程生物技術國家民委重點實驗室；寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室,寧夏銀川 750021)

乳制品由于具有較高的營養價值和保健作用,是人們生活必備食品。研究發現，發酵乳制品制作過程中的微生物與乳制品風味、口感、質地等品質密切相關[1]。乳酸菌最早被發現是乳制品加工過程中發揮作用的主要微生物[2-3]。但自從在開菲爾(Kefir)[4-7]、酸馬奶(Koumiss)[8-13]中酵母菌的重要作用被發現后,在越來越多的乳制品如:發酵駝乳酪乳清[14]、原料乳和奶酪[15-16]、奶渣[17]、曲拉和乳餅[18-19]、發酵乳[20]等中也有大量酵母菌被分離出。隨著酵母菌抑菌、降膽固醇、抗氧化、活化集體免疫系統等生理功效的發現,傳統乳制品中酵母菌越來越被關注。酸乳作為乳制品中銷售增長最快的產品,新型酸乳研發是各大乳企研發熱點,然而利用特殊酵母菌開發新型酸乳發酵菌劑卻鮮有開展。

西北、西南、東北民族地區的少數民族食用各種發酵食品有著悠久的歷史,千百年來沿襲古老而傳統的方法制作酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳餅等乳酸菌發酵食品,方法簡單、風味獨特、組織細膩、口感純正,在當地自然溫度下存放較長時間還能保證其口感和狀態。在這些傳統乳酸菌發酵食品中應該含有豐富、獨特的優良微生物資源包括酵母菌資源，這些共生酵母資源有待挖掘。

本實驗以前期從新疆、西藏和青海等地收集的傳統自制乳制品中分離的27株酵母菌為基礎,將酵母菌株分別和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)共同發酵制備酸乳,以保加利亞乳桿菌單菌發酵作為對照,通過比較凝乳時間、感官特性、質地特性、后酸度、粘度、持水力、產香能力等特征,篩選酸乳發酵中與保加利亞乳桿菌優良共生的酵母菌株,為開發新型酸乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母菌 青海西寧牦牛酸乳分離的“QX1”-“QX15”,青海大通縣酸乳中分離的“QD1”～“QD3”,山東酸乳中分離的“SD1”、“SD2”,從西藏拉薩、那曲、山南酸牦牛乳中分離的“XS1”、“XN1”～“XN6”;保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus) 菌株MUNLd1由本實驗室保存。

胰蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司;牛肉浸粉 青島海博生物公司;乙醛標準品 北京中科質檢生物技術有限公司;雙乙酰標準品 Sigma公司;酵母基因組提取試劑盒 康為世紀生物科技有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye) 北京全式金生物技術有限公司;檸檬酸二銨、檸檬酸銨、蔗糖、碘、三氯乙酸、鄰苯二胺、鹽酸、亞硫酸氫鈉、酚酞、氫氧化鈉、酒精、氯化鈣、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氫氧化鉀 化學純，天津市大茂化學試劑廠;純牛奶 伊利乳業有限責任公司。

1%鄰苯二胺 準確稱取鄰苯二胺0.25 g,溶于4 mol/L鹽酸中,置于25 mL容量瓶內,用4 mol/L鹽酸補足至刻度,貯于棕色瓶中,臨用時配制。

MRS培養基(1L) 胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、牛肉浸粉10 g、無水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、磷酸氫二鉀2.6 g、硫酸錳0.19 g,調節pH為6.2～6.4之間。

YPD培養基 1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。

26S rDNA D1/D2區引物 NL1:5′-GCATATCG GTAAGCGGAGGAAAA-3′;NL4:GGTCCGTGTTTCAA GACGG-3′;ITS1區引物 ITS1:5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGC-3′;ITS2 5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。

TMS-PRO型質構儀 美國FTC公司;NDJ-8S型粘度計 上海庚庚儀器設備公司;S1000型快速梯度PCR儀 美國Bio-Rad公司;1-14型臺式高速冷凍離心機 Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌株和保加利亞乳桿菌株的活化 取保藏的27株酵母菌和保加利亞乳桿菌株分別接入YPD、MRS液體培養基中,37 ℃,150 r/min搖床培養24 h,6000 r/min,4 ℃離心10 min,棄去上層培養液,加入無菌生理鹽水調整濃度大于1×1010cfu/mL,制成菌懸液備用。

1.2.2 酸乳的制備 參考劉敏敏[8]、余蘭[14]、李先勝[19]等方法,30 mL含蔗糖的牛奶(15%),高壓滅菌鍋95 ℃滅菌5 min,待冷卻后,接入3 mL保加利亞乳桿菌懸液和1 mL酵母菌菌懸液,40 ℃培養,記錄凝乳時間,凝乳后4 ℃冷藏24 h后熟,進行后續混菌酸乳特性評價;以接入3 mL保加利亞乳桿菌懸液和1 mL生理鹽水的樣品作為單菌發酵對照。

1.2.3 酸乳特性評價

1.2.3.1 酸乳感官評價 參考生慶海等[21]方法,制定感官評價表,將后熟24 h的酸乳取出后,隨機選15名北方民族大學生物科學與工程學院2014級食品科學與工程專業學生依據感官評價標準對其氣味、質地、口感三個指標進行感官評定,計算平均值。

表1 酸乳感官評價打分表Table 1 Sensory evaluation scale of yoghourt

1.2.3.2 酸乳持水力測定 參考張蘭威[22]的方法,準確稱取后熟24 h的酸乳15 g,4500 r/min離心10 min,取上清液,稱取質量。持水力(%)=(樣品質量-上清液質量)/樣品質量×100。

1.2.3.3 酸乳質構特性測定 參考徐鑫[23]、赫君菲[24]和楊瑩瑩[25]等方法,測試探頭型號為TMS-75 mm圓盤擠壓探頭P/75。測試條件如下:測前速率為30 mm/min;測后速率與測前速率一致;兩次壓縮之間的停留間隔:0 s;采樣速度:10 Hz;最小觸發力:0.3 N。

1.2.3.4 酸乳滴定酸度測定 按照GB 5009.239-2016[26],加5 g 4 ℃貯存1、3、7 d酸乳、40 mL冷卻煮沸水和5滴已經配好的酚酞酒精溶液(濃度為5 g/L),于250 mL三角瓶充分搖勻,用NaOH標準溶液(濃度為0.1000 mol/L)滴定至微紅色,在30 s內顏色不消失即為滴定終點,記錄消耗的NaOH標準滴定溶液毫升數。將所得結果代入公式中計算滴定酸度。

X(°T)=c×V×100/m×0.1，X-發酵乳樣品的酸度,單位為度(°T)，吉爾涅爾度°T,100 g發酵乳消耗0.1 mol/L NaOH標準溶液的體積;c-NaOH標準溶液的摩爾濃度,單位為摩爾每升(mol/L);V-滴定時消耗NaOH標準溶液體積,單位為毫升(mL);m-發酵乳樣品的質量,單位為克(g);0.1-酸度理論定義NaOH的摩爾濃度,單位為摩爾每升(mol/L)。

1.2.3.5 酸乳中雙乙酰含量測定 鄰苯二胺法[27]。標準曲線的繪制:取12支編號試管分成2排放置,并分別加0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL標準溶液各2支,分別用蒸餾水補足10 mL,取5.0 mL上述雙乙酰標準溶液加入5 mL 16%三氯乙酸溶液,得到雙乙酰標準溶液的質量濃度分別為0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 μg/mL,在335 nm波長下用石英比色皿測定吸光度值。以雙乙酰質量分數為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。樣品中雙乙酰含量的測定:取后熟24 h的酸乳10 mL加三氯乙酸(濃度為16%)溶液10 mL,靜置10 min后4500 r/min,4 ℃離心10 min,過濾后取上清液10 mL,加0.5 mL質量分數為1%的鄰苯二胺搖勻,放置黑暗處靜置30 min。待反應完全后加入濃度為4.0 mol/L的鹽酸,波長335 nm石英比色皿測定吸光度值,代入標曲計算樣品中含量。

1.2.3.6 酸乳中乙醛含量測定 滴定法[28]。取5 mL樣品加入5.00 mL三氯乙酸(質量分數為16%),充分搖勻,12000 r/min,4 ℃離心10 min,在250 mL錐形瓶中加入5 mL上清液2.00 mL 1% NaHSO3的搖勻,室溫放置1 h后,加入1 mL 1%淀粉溶液,用0.01 mol/L碘液滴至淡藍色,且在30 s不褪色即為滴定終點。再加入20 mL 1 mol/L NaHCO3,振蕩到藍色退去,再用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至淡藍色,30 s不褪去,記錄消耗標準碘液的體積,按如下公式計算乙醛的含量。

乙醛(mg/L)=(V1-V2)×c×0.022/10

式中:V2為空白滴定消耗碘液標準的體積,mL;V1為樣品滴定消耗碘液標準的體積,mL;c為1/2碘液標準溶液的濃度,mol/L;10為乙醛樣品稱樣量,mL;0.022為乙醛化學反應基本單位,g。

1.2.4 數據處理與分析 每個實驗重復3次,采用SPSS11.0軟件ANOVA對實驗數據進行方差分析,用LSD進行多重比較,圖表在Excel中生成。

1.2.5 優良共生酵母菌株分子鑒定 參照酵母菌基因組DNA提取試劑盒說明書;PCR擴增26S rDNAD1/D2區、ITS1區反應體系為(50 μL):10×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應程序為參考Kurtzman等[29]：取3 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖電泳檢測,剩余PCR擴增產物由南京金斯瑞生物公司進行測序。將測序序列在NCBI數據庫中比對鑒定。參考序列選自Kurtzman等[29],以SchizosaccharomycespombeD1D2區序列(U40085.1)和Hanseniasporaoccidentalis的ITS序列(AY046203.1)為outgroup,將所有序列輸入在Mega Ver6.0軟件[30]中打開,alignment文件,手動修正掐頭去尾,輸出fasta格式;將修正后的fasta文件用DAMBE Ver 5.3.4軟件[31]轉化成phylip 4格式(間斷)(但名稱全);再在記事本中打開,將“？”用“-”替換;用CIPRES Science Gateway[32]中在線RAxML-HPC2 Blackbaox[33]建ML進化樹;在Figtree中編輯系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 不同菌株發酵酸乳凝乳時間比較

凝乳時間與乳酸菌在酸乳發酵過程中的生長繁殖、活力、產酸能力密切相關[1],本實驗中27株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發酵樣品與對照組發酵樣品在6 h都出現部分凝乳,8 h都完全凝乳,二者并未出現明顯差別,酵母菌的加入對酸乳發酵中凝乳時間無明顯影響。

2.2 不同菌株混菌發酵酸乳感官評價比較

感官評價是酸乳品質測評的重要手段,本實驗以保加利亞乳桿菌單菌發酵酸乳為對照,對27株酵母菌與乳酸菌混合發酵后熟24 h酸乳從質地、氣味和口感方面進行感官評價,由表2可得,從青海西寧牦牛酸乳分離的“QX1”～“QX15”和青海大通縣酸乳中分離的“QD1”～“QD3”共18株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發酵酸乳樣品有明顯的酒精味,掩蓋了奶香味,但無其他異味,大多乳清析出也較多(質地得分約6分),部分有明顯的“豆腐渣”狀(質地得分約10分),口感偏甜(得分約10～15分)或酸甜分明(得分約20～25分),總體得分在80分以下;而從山東酸乳中分離的“SD1”、“SD2”和從西藏拉薩、那曲、山南酸牦牛乳中分離的“XS1”、“XN1”～“XN6”這9株酵母菌與保加利亞乳桿菌混菌發酵酸乳樣品奶香味比較明顯,也無明顯的乳清析出,質地均勻細膩,酸乳適中,融合感較好,總體得分在80分以上。因此,選擇“SD1”、“SD2”、“XS1”、“XN1”、“XN2”、“XN3”、“XN4”、“XN5”、“XN6”這9株酵母菌作為下一步實驗菌株。

表2 不同菌株發酵酸乳感官評定得分Table 2 Sensory evaluation scores of yoghourt fermented with different strains

2.3 不同菌株發酵酸乳持水力比較

酸乳持水力指酸乳保質期內乳清析出的多少,反映不同質地酸乳對乳清的截留能力,越大表示酸乳質地越優。9株酵母菌“SD1”、“SD2”、“XS1”、“XN1”、“XN2”、“XN3”、“XN4”、“XN5”、“XN6”和保加利亞乳桿菌混菌發酵后熟24 h酸乳和對照酸乳樣品的持水力均為100%,與感官評價中觀察到的乳清析出情況一致。

2.4 不同菌株發酵酸乳質構分析比較

感官評價法一般采用暫時的評分系統,局限性很大,而且這種評定費時費力,受評價員的情緒、健康狀況等多種因素影響,穩定性不足。質構儀通過模擬人的口腔咀嚼功能,用具體的數據,客觀地將人的觸覺感受分解成硬度、咀嚼性、彈性、內聚性、膠黏性等幾個部分,9株酵母菌和保加利亞乳桿菌混菌發酵酸乳樣品和對照酸乳樣品質構數據如圖1～圖4所示,“XS1”菌株混菌發酵酸乳的質構指標最好。

圖1 不同菌株發酵酸乳破裂力、硬度、粘附性Fig.1 The rupture force,adhesiveness and hardness of yoghourt fermented with different strains注:不同字母的均值間存在顯著差異(p<0.01),圖2～圖4,圖6～圖7、表3同。

圖2 不同菌株發酵酸乳最大粘附力、內聚力、膠黏性Fig.2 The tackiness,maximum adhesion force and hardness of yoghourt fermented with different strains

圖3 不同菌株發酵酸乳彈性Fig.3 Elasticity of yoghourt fermented with different strains

圖4 不同菌株發酵酸乳咀嚼性Fig.4 Chewiness of yoghourt fermented with different strains

表3 不同菌株發酵酸乳滴定酸度變化Table 3 Titratable acidity of yoghourt with different strains

2.5 不同菌株發酵酸乳滴定酸度比較

發酵結束后,后熟好的酸乳,酸度要適中,同樣發酵8 h后的樣品,所有混菌發酵酸乳的酸度都比對照高,其中菌株“XS1”混菌發酵樣品酸度最高;但冷藏保存7 d后,“XS1”混菌酸乳的后酸變化卻最小,只有4 °T,遠遠低于對照。

2.6 不同菌株發酵酸乳產香能力比較

酸乳中雙乙酰和乙醛含量與其香味有關,利用雙乙酰標準曲線(圖5),檢測9株菌混合發酵酸乳樣品以及單菌發酵對照樣品中的雙乙酰含量,除“XN3”、“XN2”、“XN5”混菌發酵酸乳雙乙酰含量明顯低于對照外(“XN3”、“XN2”、“XN5”的p值分別為0.009、0.003、0.004),其余所有的混菌發酵樣品中雙乙酰含量明顯大于對照(“XN1”、“XN4”、“XN6”、“XS1”、“SD1”、“SD2”p值分別為0.008、0.008、0.008、0.0009、0.009、0.0008),其中“SD2”最高(14.83 μg/mL),“XS1”次之(12.65 μg/mL)(圖6)。而在乙醛含量方面,只有“SD2”和“XN3”混菌發酵酸乳的乙醛含量均高于對照,“XS1”混菌發酵酸乳的乙醛含量低于對照,其余樣品于對照無顯著差異(圖7)。

圖5 雙乙酰標準曲線Fig.5 The standard curve of diacetyl

圖6 不同菌株發酵酸乳中雙乙酰含量Fig.6 The content of diacetyl in yoghourtfermented with different strains

圖7 不同菌株發酵酸乳中乙醛含量測定結果Fig.7 The content of acetaldehyde in yoghourt fermented with different strains

2.7 優良共生酵母菌株“XS1”的鑒定結果

菌株“XS1”在YPD培養基上菌落形態均為白色、圓形或橢圓形、不透明、有粘性、光滑濕潤,美蘭染色后顯微孢子形態為橢圓形、圓形或卵圓形,可見出芽生殖(圖8),提取該菌株基因組DNA,采用PCR擴增26S rDNA D1D2和ITS1序列。測序后分別獲得約650 bp和300 bp序列,將該序列在NCBI中比對,結果顯示“XS1”的26S rDNA D1D2和ITS1序列與Kluyveromycesmarxianus的序列相似度高達99%;基于Holzapfel等分類系統參考序列,利用“XS1”菌株的26S rDNA D1D2和ITS1區序列,分別構建進化樹,結果顯示“XS1”與Kluyveromycesmarxianus聚在一起(圖9、圖10)。得出“XS1”為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)菌株。

圖8 “XS1”菌落圖片和細胞顯微圖片Fig.8 The colony and cell of “XS1” strain

圖9 基于26S rDNA D1D2區構建的Kluyveromyces屬系統發育樹Fig.9 The phylogenetic tree of Genus Kluyveromyces based on 26S rDNA D1D2 sequences

圖10 基于ITS1區構建的Kluyveromyces屬系統發育樹Fig.10 The phylogenetic tree of Genus Kluyveromyces based on ITS1 sequences

3 討論

乳酸菌和酵母菌是食品工業中應用最廣泛的兩種微生物。長期以來,乳制品中的酵母僅作為一種污染菌和腐敗菌而備受人們關注,隨著各種乳制品中酵母被大量分離,酵母菌在乳制品中的有益作用開始被關注,尤其是馬克斯克魯維酵母被發現是開菲爾[4-5]和酸馬奶[11-13]中的優勢酵母菌。隨著對發酵乳制品中酵母菌研究的深入,越來越多的馬克斯克魯維酵母菌在其他各種乳制品中不斷被分離出來[34],Bai等[20]分別從青海地區和西藏地區傳統發酵牦牛酸乳中分離出馬克斯克魯維酵母;王遠微等[35]報道對川西北部分牧區的傳統發酵牦牛酸乳樣品中酵母菌優勢菌是馬克斯克魯維酵母;謝婕等[36]發現羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中分離到的酵母菌中有17株是馬克斯克魯維酵母;李宇輝等[37]報道馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是新疆伊犁牧區少數民族家中采集奶疙瘩樣品中的共同菌株;李銀聰[38]發現西藏和川西青藏高原牧民自制的自然發酵酸耗牛奶也存在馬克斯克魯維酵母。本實驗中篩選的馬克斯克魯維酵母菌株“XS1”從西藏山南地區收集的牦牛酸乳樣品分離獲得。

本實驗將保加利亞乳桿菌和酵母菌混菌發酵制備酸乳,混菌發酵的優勢在于通過不同代謝能力菌種的組合,完成單個菌種難以完成的多種復雜代謝反應,提高生產效率。目前關于混菌發酵過程中酵母菌和乳酸菌之間的共生作用研究甚少。有報道在乳制品發酵過程中,乳酸菌首先利用環境中的乳糖生長,通過自身的代謝途徑反應生成乳酸降低了環境的pH,為酵母菌的代謝提供了條件,因為酵母菌最適宜在偏酸性環境中生長,同時一些乳酸菌發酵乳糖的副產物為半乳糖,能夠為不發酵乳糖而利用半乳糖的酵母提供碳源;另一方面,乳酸菌產生的乳酸引起pH降低會對自身的代謝產生抑制作用,此時酵母菌在生長消耗乳酸鹽,環境pH就不斷升高,這樣就減緩了環境中的pH太低而導致乳酸菌的反饋抑制。另外,酵母菌代謝所產生的物質,如丙酮酸、維生素和氨基酸等其他復合物也會刺激乳酸菌進一步代謝,這就為兩種菌之間的相互促進提供了良好的基礎[39-40]。本實驗部分菌株混菌發酵結果也證明了這種相互促進作用，但僅使用一種保加利亞乳桿菌和酵母菌混合發酵酸乳進行研究,實際生產中常使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復合發酵,球菌、桿菌有各自不同的發酵特性,發酵產物也有差異,菌株越多相互關系就越復雜,以初步篩選的混菌發酵酸乳在感官評價得分較高9株酵母菌為基礎,研究保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酵母菌混合發酵對酸乳的影響,是本實驗下一步的工作。

不同類型發酵酸乳中酵母菌和乳酸菌的相互作用可能存在差異,乳酸菌和酵母菌的種類及其接種比例、發酵條件都有可能影響兩者之間的共生作用,本實驗只選擇了乳酸菌和酵母菌比例是3∶1,培養條件也只選擇了保加利亞乳桿菌最佳生長溫度40 ℃,對于其他條件參數還需后續研究。

4 結論

本實驗以保加利亞乳桿菌單菌發酵為對照,從27株酵母菌中篩選獲得1株馬克斯克魯維酵母菌株“XS1”,該菌株與保加利亞乳桿菌混菌發酵的酸乳在質地特性、后酸度、粘度、持水力、產香能力等方面表現優良,有望應用于開發獨特風味和口感的酵母菌-乳酸菌復合發酵酸乳。

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