2016～2017年嘉興一院結核分枝桿菌耐藥情況及其耐藥機制研究

袁亞芳 潘稚芬

[摘要] 目的 了解嘉興一院2016～2017年結核分枝桿菌耐藥狀況，并利用比較蛋白質組學研究其可能存在的耐藥機制，為耐藥結核病的防控策略提供科學依據。 方法 對2016年1月～2017年6月嘉興一院746株結核分枝桿菌進行培養及藥敏試驗分析，采用雙向電泳技術比較臨床不同耐藥菌株與敏感菌株的全菌蛋白表達圖譜，利用基質輔助激光解吸及電離飛行時間質譜儀進行質譜分析，通過蛋白質數據庫對差異表達蛋白質相應的基因進行序列分析。 結果 746株結核分枝桿菌中總耐藥率為18.50%（138/746），單耐藥率為9.92%（74/746），耐多藥率為4.42%（33/746），多耐藥率為4.16%（31/746）。4種藥物的耐藥率由高到底依次為異煙肼（INH，11.53%，86/746）、鏈霉素（Sm，10.86%，81/746）、利福平（RFP，5.36%，40/746）、乙胺丁醇（EMB，4.29%，32/746）。初治耐藥率及復治耐藥率分別為17.22%（115/668）、29.49%（23/78），復治耐藥率高于初治（χ2=6.976，P<0.01）；從蛋白質組學功能分析結核分枝桿菌可能存在的耐藥機制，發現了21個耐藥結核桿菌的差異表達蛋白，其中5個蛋白的檢出率在耐藥菌株中相對較高，質譜分析獲得明確的肽質量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。 結論 嘉興一院近2年結核分枝桿菌耐藥率保持在較低水平，且發現Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c與其耐藥機制密切相關。

[關鍵詞] 結核分枝桿菌；耐藥譜；比較蛋白質組學；耐藥機制

[中圖分類號] R52 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）07-0071-05

[Abstract] Objective To investigate the status of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis（Mtb） and drug resistance related proteins， providing the basis for drug-resistant MTB prevention and control. Methods A total of 746 Mtb strains between January 2016 and June 2017 were cultured and anti-tuber-colosis drug susceptibility tests， the drug resistance of 4 kinds of anti-tuberculosis drugs was analyzed. The proteins extracted from different clinical drug resistant Mtb strains and susceptible Mtb strains were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Protein spots remarkly increased in different clinical drug resistant Mtb strains were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides were measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALdI-TOF-MS）. The date obtained from peptide mass fingerprinting were used in protein database search. These genes of all strains were sequenced. Results The total resistance rate was 18.50%（138/746）， multi-drug-resistant rate was 4.42%（33/746）， mono-drug-resistant rate was 9.92%（74/746）， poly-drug-resistant rate was 4.16%（31/746）. Drug resistance rates ranked from high to low as isoniazid（INH， 11.53%，86/746）， streptomycin（Sm， 10.86%，81/746）， rifampicin（RFP， 5.36%，40/746）， ethambutol（EMB， 4.29%， 32/746）. nitial drug resistance rate and acquired drug resistance rate was 17.22%（115/668） and 29.49%（23/78） respectively， and acquired drug resistance rate was higher than the initial drug resistance rate，there was a statistically significant difference（χ2=6.976，P<0.01）. In all protein spot differences， 5 protein spots were upregulated inisoniazid-resistant strains and identified as Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c by （MALdI-TOF-MS）. Conclusion Mycobacterium tuberculosis resistant rate remains at low levels in the First Hospital of Jiaxing nearly two years.5 protein spots（Rv0444c， Rv1446c， Rv3146， Rv3002c and Rv2159c） might be associated with drug resistance mechanism.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Drug-resistant spectrum； Comparative proteomics； Drug resistance mechanism

結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一種慢性傳染病。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，耐藥結核病的傳播流行是目前我國結核病疫情居高不下的重要原因，其出現和蔓延，嚴重阻礙了我國結核病防治工作的進程，已成為嚴重的公共衛生和社會問題。

現有的結核診療技術已經無法應對國內外日益嚴峻的結核病疫情，圍繞這一疾病的預防、早期診斷和治療等全面開展研究，據此推動結核分枝桿菌免疫、致病、耐藥機制等基礎研究的前進步伐，不僅是結防工作者的共識，也是中國作為世界耐藥結核“特別引起警示的國家和地區”的現實需求，在這種情況下，分析本院2016～2017年結核分枝桿菌的耐藥情況，應用比較蛋白質組學技術了解結核分枝桿菌蛋白質結構及空間差異、相互作用與聯系，進一步闡述耐藥分子機制顯得尤為必要。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 調查對象 選擇2016年1月～2017年6月嘉興市第一醫院痰結核分枝桿菌培養陽性的結核病患者746例。患者基本情況見表1。

1.1.2 菌株來源 培養陽性的菌株均在嘉興市第一醫院結核病實驗室統一做藥敏試驗，選擇其中經藥敏試驗鑒定的單耐異煙肼菌株（3株）、單耐利福平菌株（3株）和耐多藥菌株（4株）（其中包括異煙肼+利福平、異煙肼+利福平+乙胺丁醇、異煙肼+利福平+鏈霉素、異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇）；結核分枝桿菌標準菌株H37Rv（由國家參比實驗室提供）。

1.1.3 主要儀器 PowerPac 3000電泳儀，PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀，PROTEAN Ⅱ Xi Cell垂直板電泳儀，Molecular Image Fx凝膠圖像掃描儀，PDQuest6.0圖像分析軟件，均為美國Bio-Rad公司產品。U-3000分光光度計為HITACHI公司產品，質譜分析系統為美國Applied Biosystems公司的Voyager System 6192基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）。

1.2 方法

1.2.1 臨床耐藥結核分枝桿菌藥敏試驗 （1）746株痰培養陽性的結核分枝桿菌均選擇異煙肼（0.l mg/L）、利福平（1.0 mg/L）、鏈霉素（1.0 mg/L）和乙胺丁醇（5.0 mg/L）4種常用抗結核藥物進行體外藥物敏感試驗，采用《耐藥檢測指南》推薦的比例法，計算耐藥百分比。（2）耐藥分類：單耐藥：結核分枝桿菌對一種抗結核藥物耐藥。多耐藥：結核分枝桿菌對一種以上的抗結核藥物耐藥，但不同時包括異煙肼、利福平。耐多藥：結核分枝桿菌對一種以上的抗結核藥物至少同時包括異煙肼、利福平耐藥。（3）藥敏試驗均采用已知參考標準的結核敏感株（H37Rv）作為質量控制對照。

1.2.2 臨床耐藥結核分枝桿菌的細菌學實驗 利用掃描電鏡、透射電鏡分析泛耐藥菌株細胞形態、細胞壁形態變化

1.2.3 結核分枝桿菌培養及蛋白質組分分離 將菌株接種到添加了10%ADC（0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl）和0.5%甘油的Middlebrook 7H9中，37℃恒溫培養箱中靜置培養15～20 d，菌體濃度為1×108～2×108或光密度（OD600）為0.8～1.0收取菌體。80℃水浴加熱0.5 h以殺死細菌。超聲破壁，獲得細胞組份蛋白。

1.2.4 利用比較蛋白質組學方法分析耐藥結核分枝桿菌的差異表達蛋白 應用生物信息學理論和技術，綜合分析獲得的若干耐藥結核桿菌和藥物敏感菌株之間的差異蛋白。蛋白質組學方法—雙向電泳技術（2D-Electrophoresis）：第一向：固相pH梯度等電聚焦凝膠電泳（用自制的電泳上樣緩沖液，17 cm的膠條，pH 4～7、3～10）。采用被動水化，低電壓膠內泡脹法。聚焦結束后，立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳。第二向：聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，將IPG膠條面朝上放在凝膠的長玻璃板上。起始時用低電流（5 mA/gel/17 cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20～30 mA/gel/17 cm），溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。取出凝膠，并切角以作記號。

1.2.5 肽指紋圖譜鑒定與分析 蛋白凝膠銀染后，凝膠用Molecular Image Fx激光圖像掃描儀掃描，配比分析采用PDQuest 6.0軟件完成。

篩選差異蛋白質斑點，加適量消化液（50 mmol/L NH4HCO3，5 mmol/L CaCl2，12.5 ng/μL Trypsin）消化，抽干，加0.5%TFA溶解。MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜分析并鑒定PepIdent（www.expasy.org/tools/peptident.pl）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件統計分析數據。計量資料用（x±s）表示，計數資料以描述性統計分析，對耐藥率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥基本情況

746株結核分枝桿菌中，608例對4種抗結核藥物全部敏感，占81.50%，138例患者耐藥，總體耐藥率為18.50%；其中單耐藥74例，單耐藥率為9.92%；耐多藥33例，耐多藥率為4.42%；多耐藥31例，多耐藥率為4.16%。4種藥物的耐藥率由高到底依次為H 11.53%（86/746）、S 10.86%（81/746）、R 5.36%（40/746）、E 4.29%（32/746）。見表2。

2.2 耐藥譜分析

四種藥物均有單耐藥情況發生；耐多藥有四種組合：HR、HRS、HRE、HRSE；多耐藥有五種組合：HS、HE、RS、SE、HSE。單耐藥以耐S最多，耐多藥以耐HRSE最多，其次是HR，多耐藥以耐HS最多。初治患者耐藥順位為S（10.78%，72/668）、H（10.03%，67/668）、R（14.07%，27/668）、E（3.89%，26/668），復治患者耐藥順位為H（24.36%，19/78）、R（16.67%，13/78）、S（11.54%，9/78）、E（7.69%，7/78）。見表3。

2.3 初復治患者耐藥情況分析

初治患者668例中耐藥115例，初治總耐藥率為17.22%；耐多藥21例，初治耐多藥率為3.14%。復治患者78例中耐藥23例，復治總耐藥率為29.49%；耐多藥12例，復治耐多藥率為15.38%。復治總耐藥率高于初治總耐藥率（χ2=6.976，P<0.01），復治耐多藥率高于初治耐多藥率（χ2=24.753，P<0.01）。

2.4 耐藥結核分枝桿菌的比較蛋白質組學研究結果

運用PDQuest6.0圖像分析軟件對臨床不同耐藥模式菌株、全敏菌株及H37Rv菌株進行分析，共發現21個差異表達蛋白點，經切割消化后，進行MALDI-TOF-MS檢測，并根據試驗方法中敘述的數據庫搜索方法對這些差異點進行鑒定（表4）。其中5個蛋白的檢出率在耐藥菌株中相對較高、質譜分析獲得明確的肽質量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c（封三圖2、圖3，表5）。

3 討論

本研究746株結核分枝桿菌中，總耐藥率為18.50%（138/746），耐多藥率為4.42%（33/746），其中初治耐藥率和復治耐藥率分別為17.22%（115/668）、29.49%（23/78），初治耐多藥率和復治耐多藥率分別為3.14%（21/668）、15.38%（12/78），耐單藥順位從高到低依次為INH（11.53%）、Sm（10.86%）、RFP（5.36%）、EMB（4.29%），與2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果相比（總耐藥率為36.8%，初治耐藥率為36.9%，復治耐藥率35.9%，總耐多藥率6.8%，初治耐多藥率為5.4%，復治耐多藥率為15.4%，耐藥順位為INH 28.6%、Sm 19.6%、RFP 8.9%、EMB 6.8%），耐藥率略低于全國流調水平[1]。單耐藥率為9.92%（74/746），耐多藥率為4.42%（33/746），低于潘稚芬等[2]報道的嘉興一院2004～2010年耐藥監測結果（單耐藥率為17.28%，耐多藥率為27.84%）。究其原因是由于嘉興市第一醫院自2013年以來開展了全球基金耐多藥防控策略，其中包括所有涂陽肺結核患者早期結核分枝桿菌液體培養，GeneXpert、基因芯片等快速分子生物學檢測技術的應用；確診的耐藥肺結核患者均給予免費治療，每一例患者治療方案均由市級專家組討論決定，根據患者實際病情，使用標準及個體化相結合的耐藥結核治療方案，劑量根據藥代動力學特征計算，嚴格執行2個月住院治療（靜脈用藥），6個月強化期（注射）治療，18個月鞏固期治療；輔以醫務人員全程督導，并適當給予患者營養及交通補助，提高服藥的依從性，以上措施使肺結核的治愈率達到85%以上，耐多藥肺結核的治愈率也達到70%以上，本研究結果說明近四年嘉興一院耐多藥肺結核病防控策略取得了一定的成效。

利用比較蛋白質組學方法分析耐藥結核分枝桿菌的差異表達蛋白，發現差異表達的21個蛋白質點中，新增2個、缺失6個、8個上調表達、2個下調表達、3個異常表達。這些差異蛋白主要為中間代謝/呼吸作用蛋白、調節蛋白、細胞壁和細胞外排系統和PE/PPE成員相關蛋白及保守假定蛋白。質譜分析后獲得5個明確的肽質量指紋圖譜，分別為Rv0444c、Rv1446c、Rv3146、Rv3002c、Rv2159c。

Rv2629c編碼的是一種保守假定蛋白，研究發現，這種蛋白是結核分枝桿菌進入潛伏生長狀態高表達標志蛋白，存在于細胞膜和細胞壁，與利福平耐藥機制密切相關。耐藥菌可以通過降低生活能力，進入潛伏狀態來抵抗外界的不良環境，或以這種進入潛伏狀態的方式降低與藥物的作用效率，從而降低或抵抗抗生素對其的殺滅作用[3]。研究發現結核分枝桿菌胞內生長72 h后，耐藥株中Rv2629基因上調明顯。另有動物實驗發現[4]過表達Rv2629的細菌感染小鼠20 d后，其臟器存活數多于對照組。而小鼠肺泡結構被炎性浸出物滲透和炎性細胞浸潤，肺泡壁充血增厚，有明顯的肉芽腫形成。以上結果均說明耐藥菌株中過表達的Rv2629可能提高其存活率和致病性，與其耐藥機制密切相關。進一步研究[5]發現Rv2629蛋白可能屬于藥泵體系，該體系最常見的主要是易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）和ATP結合盒家族（ATP-binding cassette，ABC），但具體屬于哪一種類型及其所發揮的具體機制都需要進一步證據加以證實。

RshA是由Rv0444c表達的一種SigK操縱子抑制蛋白，該蛋白在臨床耐多藥菌株中表達下調，說明Rv0444c可能是與耐藥相關的基因。耐藥結核桿菌通過RskA的下調表達，弱化了對SigK的負調控，導致MPT83抗原蛋白的上調表達，并通過光鏡發現Rv0444c的過表達可導致菌落邊緣整齊，折光性增強，細胞壁有增厚趨勢，由此可推測增厚的胞壁減低了抗結核藥物穿胞殺菌作用[6]，然而實驗發現MPT83抗原蛋白的上調表達卻不影響耐藥菌生長。另有研究[7]稱該蛋白還能夠介導細菌對阿米卡星、卷曲霉素耐藥。

Rv1446c編碼的opcA蛋白是一種膜蛋白，其功能可能是磷酸戊糖途徑中輔助葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的一種蛋白質。研究發現Rv1446c參與耐異煙肼結核分枝桿菌耐藥機制形成[8-10]。目前對該蛋白質的深入研究少有報道。Rv2159c編碼的是一種保守假定蛋白，亦屬于結核分枝桿菌膜蛋白，該蛋白在耐多藥菌株和單耐異煙肼菌株中都呈下降趨勢，可能會導致結核分枝桿菌對宿主的侵襲能力下降[11]。Rv3002c編碼的是乙酰羥酸合成酶小亞基（ilvN），該蛋白存在于支鏈氨基酸代謝途徑，ilvN僅在臨床耐多藥株中新增表達，為耐多藥發生機制提供線索，并可能成為抗耐多藥結核的藥物設計靶標和可能的耐藥檢測標準[12-13]。Rv3146又叫做NADH-CoQ氧化還原酶B鏈（nuoB），其在雙耐藥菌株的菌體蛋白中表達異常，屬于中間代謝和呼吸作用相關蛋白[14]。對nuoB蛋白的抗原表位分析發現，其可在耐多藥結核患者中激起較高水平的體液免疫反應，具有耐藥結核血清學鑒別診斷的能力[15]。

綜上所述，嘉興一院結核病患者總體耐藥率略低于2010年全國流調水平，這得益于本地區有效的防控措施，但復治患者耐藥率、耐多藥率高于初治患者，且初復治耐藥順位不同，因此，在治療時應根據患者不同類型、藥敏試驗及本地區結核分枝桿菌耐藥特點，制定個體化的化療方案[16-17]。另外，應用比較蛋白質組學的方法，找到了臨床不同耐藥菌株和敏感株之間差異表達蛋白，但這些蛋白耐藥機制仍需進一步的實驗證實。上述蛋白是篩選新型藥物和診斷抗原的焦點，本研究為尋找新的藥物靶標以及篩選不同臨床耐藥模式菌株診斷抗原提供方向，并為今后本地區耐藥結核科學防控策略提供科學依據。

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（收稿日期：2018-01-04）