組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯合HPV16E7—DNA疫苗治療宮頸癌的效果及機制研究

黃卓敏 李晴 姚秀華 金平

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACI）伏立諾他（SAHA）聯合人乳頭瘤病毒16 E7-DNA（HPV16E7-DNA）疫苗治療宮頸癌的效果及免疫機制。 方法 建立TC-1宮頸癌小鼠模型，負瘤第5天，采用隨機數字表法將小鼠分為HPV16E7-DNA組、SAHA組、SAHA聯合HPV16E7-DNA組、對照組，用藥方案：HPV16E7-DNA組給予疫苗5 μg/kg，SAHA組給予SAHA 20 mg/kg，SAHA聯合HPV16E7-DNA組給予疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg，對照組給予100 μL磷酸鹽溶液（PBS）。每3天1次，共4次。繪制腫瘤生長曲線；流式細胞儀檢測各組小鼠外周血CD8+T細胞的數量；體外實驗檢測不同劑量SAHA（25.0、12.5 nmol/L）對TC-1細胞MHCⅠ類分子H-2Kb表達的影響。 結果 與其他三組比較，SAHA聯合HPV16E7-DNA組的腫瘤生長速度明顯減慢，小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞的數量增高（P < 0.05）。體外實驗結果提示，與對照組比較，SAHA組細胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達明顯增高（P < 0.05），低劑量與高劑量SAHA組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 HDACI聯合HPV16E7-DNA疫苗可能通過上調腫瘤細胞MHCⅠ類分子的表達，激活機體CD8+T細胞免疫反應，從而產生明顯的抗腫瘤效應，有望用于宮頸癌的免疫治療。

[關鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶抑制劑；HPV16-E7疫苗；宮頸癌；CD8+T細胞；MHCⅠ類分子

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of combination of histone deacetylase inhibitor （HDACI） Suberoylanilide Hydroxamic Acid （SAHA） combined with human papilloma virus 16 E7-DNA （HPV16E7-DNA） vaccine in the treatment of cervical cancer and its immunological mechanism. Methods The model of mice with TC-1 cervical cancer was made， then on the 5th day after tumor bearing， the mice were randomly divided into HPV16E7-DNA group， SAHA group， SAHA and HPV16E7-DNA group， control group by random number table method. The therapeutic regimen was as followed： HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg， SAHA group was given SAHA 20 mg/kg， SAHA and HPV16E7-DNA group was given vaccine 5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg， the control group was given 100 μL phosphate solutions （PBS）. Once every 3 days， total for 4 times. The tumor growth curve was drawn； the amount of CD8+T cells in peripheral blood of mice in each group was detected by flow cytometry； the effects of different doses of SAHA （25.0， 12.5 nmol/L） for the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in TC-1 cells were detected by experiment in vitro. Results Compared with the other three groups， the tumor growth rate in SAHA and HPV16E7-DNA group was significantly slowed down， the amount of HPVE7 specific CD8+T cells in peripheral blood of mice was significantly increased （P < 0.05）. In-vitro experiment showed that compared with control group， the expression of H-2Kb of MHC class Ⅰ in SAHA group was increased significantly （P < 0.05）， while there was no significant difference between low dose of SAHA group and high dose of SAHA group （P > 0.05）. Conclusion HDACI combined with HPV16E7-DNA vaccine comes into significant anti-tumor effects may be through up-regulating expression of MHC class Ⅰ of the tumor cells and activating the immune response of CD8+T cells， which is expected to be used in the immunotherapy of cervical cancer.

[Key words] Histone deacetylase inhibitor； HPV16E7-DNA vaccine； Cervical cancer； CD8+T cells； MHC class Ⅰ

宮頸癌在全球婦女的癌癥死因中居第2位，嚴重威脅女性健康。高危型人乳頭瘤狀病毒（HR-HPV）是宮頸癌發生的主要病因，HPV16病毒基因E7是主要致癌基因。宮頸癌傳統的治療包括手術、放療及化療等，治療創傷大，不能防止HPV再次感染[1]。以HR-HPVE7為靶點研制治療性DNA疫苗，將為宮頸癌的防治開辟一條全新的途徑，但是DNA疫苗本身的免疫原性弱，單獨應用并不能起到良好的抗腫瘤效應[2-3]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）與DNA疫苗聯合應用，能增加DNA疫苗編碼蛋白質的表達，上調MHCⅠ、Ⅱ類分子的表達，從而增強DNA疫苗的抗腫瘤免疫效應[4]。本研究制備HPV16E7-DNA疫苗，聯合HDACI類藥物伏立諾他（Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA）對宮頸癌負瘤小鼠進行免疫治療，探討其對宮頸癌的治療效果及其可能的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源及培養

小鼠宮頸癌細胞系TC-1由美國霍普金斯大學醫學院TC WU教授惠贈。細胞培養于含10%小牛血清的高糖DMEM培養基中，置于含5%CO2的37℃培養箱中，0.25%胰酶消化傳代，1～2 d更換培養液。

1.2 HPV16E7-DNA疫苗的制備、純化及檢測

以大腸埃希菌作為表達載體，pcDNA3.1（+）作為表達質粒，BamHI/XhoI作為限制性核酸內切酶，構建HPV16E7-DNA疫苗。

1.3 試劑的購買與配制

SAHA購自購于Cayman公司，為白色粉末，使用二甲基亞砜（DMSO）溶液給予溶解稀釋備用。抗PE-HPV16-E7四聚體由商業公司合成。FITC-CD8a、抗PE-H2Kb均購自商業公司。藥物及試劑的配制及使用按說明書進行。

1.4 宮頸癌負瘤小鼠模型的建立及免疫治療方案

1.4.1 實驗動物 選用健康近交系C57BL/6小鼠，5周齡，雌性，體重20～30 g，購自北京維通利華動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0011。按三級動物要求，飼養在無特定病原體環境中，所用飼料、飲水及墊料均經高壓滅菌處理。

1.4.2 動物實驗分組及用藥方案 于小鼠左側下腹部皮下注射1×105 TC-1細胞建立宮頸癌模型，負瘤第5天，小鼠下腹部腫瘤大小約0.5 cm。應用隨機數字表法將小鼠分為四組（每組10只）：HPV16E7-DNA組、SAHA組、SAHA聯合HPV16E7-DNA組、對照組。用藥方案：HPV16E7-DNA組給予DNA疫苗5 μg/kg；SAHA組給予SAHA 20 mg/kg；SAHA聯合HPV16E7-DNA組給予DNA疫苗5 μg/kg+SAHA 20 mg/kg；對照組給予磷酸鹽緩沖溶液（PBS）100 μL。每3天1次，共4次。用藥途徑：DNA疫苗給予肌內注射；SAHA與PBS給予腹腔注射。

1.5 測量腫瘤生長情況

自負瘤第5天開始，每3天測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b）至免疫治療結束第8天，按a×b2/2公式計算腫瘤體積，取各組平均值。

1.6 流式細胞儀檢測小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞的數量

治療結束第8天取小鼠尾靜脈血，裂解紅細胞，制備單細胞懸液，加入抗PE-HPV16-E7四聚體0.5 μL（0.1 μg）與FITC-CD8a 1 μL（0.2 μg），4℃孵育30 min，流式細胞儀檢測HPV16-E7四聚體陽性的CD8+T細胞數量，FlowJo軟件進行數據分析。

1.7 流式細胞儀檢測SAHA對TC-1細胞MHC1類分子表達的影響

將TC-1細胞懸液轉移至6孔平板，細胞濃度為2×105/孔，高劑量SAHA組（25.0 nmol/L），低劑量SAHA組（12.5 nmol/L），對照組（PBS），37℃培養24 h。收集細胞，制成單細胞懸液，加入抗PE-H-2Kb 0.5 μL（0.1 μg），4℃孵育30 min，流式細胞儀檢測各組TC-1細胞MHC1類分子H-2Kb的表達，FlowJo軟件進行數據分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件包進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腫瘤的生長情況

與對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組比較，SAHA聯合HPV16E7-DNA組的腫瘤體積20、23 d明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組三組組間腫瘤體積比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞數量比較

與對照組、HPV16E7-DNA組和SAHA組比較，SAHA聯合HPV16E7-DNA組的小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞數量明顯增高，差異有統計學意義（P < 0.05）；對照組、HPV16E7-DNA疫苗組和SAHA組三組組間小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞數量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1～2。

2.3 SAHA對TC-1細胞MHC1類分子H-2Kb表達的影響

與對照組比較，SAHA組細胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達明顯增高，差異有統計學意義（P < 0.05）；低劑量與高劑量SAHA組之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

目前中國每年宮頸癌的新發病例約13萬，發病率居世界第二，嚴重威脅女性健康[5]。以HR-HPV-E7為靶點研發DNA疫苗，對宮頸癌進行免疫治療，為該類疾病的防治開辟新的途徑。DNA疫苗性質穩定，無MHC限制性，可制成多價疫苗，用于治療多型別HPV感染的宮頸癌。但DNA疫苗的免疫原性弱，而宮頸癌患者的免疫系統處于抑制狀態，不能誘發機體產生理想的免疫應答[6]。近年來，學者們通過不同的途徑，試圖增強HPV-DNA疫苗的免疫原性[7-8]。

宮頸癌細胞MHCⅠ類分子表達下降或缺失，使腫瘤細胞不能為CD8+T細胞識別并殺傷，造成免疫逃逸[9]；HR-HPV病毒本身也能逃避宿主免疫系統的攻擊而不被清除[10-11]。因此，提高宮頸癌細胞MHCⅠ類分子的表達是宮頸癌免疫治療的重要策略。HDACI類藥物SAHA，通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉移、降低腫瘤侵襲力等機制發揮抗腫瘤作用[12]。研究表明，SAHA與DNA疫苗聯合應用，通過增加DNA疫苗編碼蛋白質的表達，上調MHC分子的表達，從而產生免疫治療效應[13-17]。本研究結果顯示，SAHA能提高宮頸癌細胞MHCⅠ類分子H-2Kb的表達；而在低劑量與高劑量SAHA組之間比較，宮頸癌細胞MHCⅠ類分子表達的差異無統計學意義。低劑量SAHA即可上調腫瘤細胞MHCⅠ類分子的表達，說明該藥物的作用是非劑量依賴性的，與文獻報道相符[18]，其機制有待于進一步探討。低劑量可減輕藥物的不良反應，增加藥物的安全性。

本研究顯示，SAHA聯合HPV16E7-DNA疫苗治療后，小鼠外周血HPV16E7特異性CD8+T細胞的數量明顯升高。HPV16E7-DNA疫苗可激活機體抗HPV16E7特異性CD8+T細胞，而SAHA通過提高腫瘤細胞MHCⅠ類分子的表達，使腫瘤細胞更容易被機體CD8+T細胞識別、捕獲和殺傷，SAHA聯合HPV16E7-DNA疫苗可產生協同效應，顯著增強小鼠HPV16E7特異性CD8+T細胞的增殖活化，及其殺傷腫瘤細胞的免疫反應。最新文獻報道，SAHA直接作用于HPV16/18 LCR、E6與E7基因，從而抑制宮頸癌細胞的生長[19-20]。

綜上所述，HDACI聯合HPV16E7-DNA疫苗用于治療宮頸癌，可通過上調腫瘤細胞MHCⅠ類分子的表達，激活機體的CD8+T細胞的免疫反應，從而產生有效的抗腫瘤作用。本研究為臨床宮頸癌的治療開拓了新的思路。關于HDACI類藥物聯合HPV16E7-DNA疫苗應用于宮頸癌免疫治療的可行性與安全性，仍需進一步的臨床試驗作深入探討。

[參考文獻]

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