Fe3O4納米顆粒的制備及成像分析

鄧寒霜，李筱玲，高明明

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.西安凱立新材料股份有限公司，陜西 西安 710201）

磁性納米材料在磁流體、 磁性熒光納米顆粒成像、磁熱療、磁靶向藥物載體、細(xì)胞標(biāo)記、蛋白質(zhì)純化等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1］。目前，對以鐵磁性納米材料（如Fe3O4，γ-Fe2O3）為代表的磁性納米材料的研究已經(jīng)取得了較大進展。Fe3O4納米顆粒具有獨特的表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，在熱、電、光、磁等方面應(yīng)用廣泛［2］。Fe3O4納米顆粒在交變磁場下能夠產(chǎn)熱，可通過磁熱療的方式將腫瘤細(xì)胞殺死［3］；Fe3O4納米顆粒在人體內(nèi)血液循環(huán)時間較長，能夠與藥物分子以共價鍵或靜電吸附的形式相結(jié)合，可作為理想的藥物載體［4］；Fe3O4納米顆粒能夠快速、高效進行細(xì)胞分離［5］和蛋白質(zhì)純化等［6］；Fe3O4磁性納米顆粒具有較高的空間分辨率，可在核磁共振成像中用于T1（正增強顯影）和T2（負(fù)增強顯影）造影劑［7-8］。

活體磁共振（MR）成像技術(shù)由于具有分辨率高的特點已在臨床得到廣泛應(yīng)用［9］。目前，臨床MR成像中使用的造影劑主要分為順磁性、鐵磁性和超順磁性［10-12］。Fe3O4納米顆粒的尺寸范圍從幾個納米到幾十個納米，受到表面效應(yīng)的影響極易發(fā)生團聚現(xiàn)象，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǖ玫皆谒嘀蟹€(wěn)定、弛豫性能高、毒性小、均勻分散的納米顆粒是研究者需要解決的難題。

本工作選用高溫溶劑熱分解法制備油相Fe3O4納米顆粒［13］。通過控制Fe3O4納米顆粒的粒徑大小、形貌、表面功能化修飾，提高納米顆粒的弛豫性能、穩(wěn)定性及生物相容性，并賦予Fe3O4納米顆粒熒光特性，為Fe3O4納米顆粒在MR成像中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

油酸（AR）、無水乙醇（AR）、1，2-十六烷二醇（純度97%（w））、苯基醚（純度大于99%（w））：阿拉丁試劑公司；油酸鐵、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）：AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯亞胺（PEI）：純度99%（w），廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸酯（FITC）：純度大于95%（w），上海金穗生物科技有限公司。

1.2 納米顆粒的制備

4 nm油相Fe3O4納米顆粒的制備：將一定量油酸鐵和1，2-十六烷二醇加入到油酸、苯基醚、油胺的混合溶劑中。充N2、磁力攪拌條件下，將混合體系升溫至120 ℃，陳化排除體系水后，在冷凝回流條件下升溫至250 ℃并恒溫反應(yīng)一段時間，反應(yīng)結(jié)束后冷卻產(chǎn)物至室溫。向混合物中加入無水乙醇，離心洗滌，收集黑色沉淀產(chǎn)物，正己烷重新分散后加入無水乙醇，重復(fù)離心洗滌三次，干燥得黑色油相Fe3O4納米顆粒。

Fe3O4-PEI納米顆粒的制備：取干燥黑色油相Fe3O4納米顆粒及PEI溶解于一定量氯仿中，超聲一定時間后置于圓周型恒溫?fù)u床上40 ℃下反應(yīng)。反應(yīng)完后在30 ℃下干燥使溶劑完全揮發(fā)。將干燥后的Fe3O4納米顆粒加入去離子水中超聲，離心得水相Fe3O4-PEI納米顆粒。

磁性熒光Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的制備：取一定量水相Fe3O4-PEI納米顆粒溶于去離子水中，用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0。用DMSO溶解FITC，并加入到水相Fe3O4-PEI納米顆粒水溶液中，混合均勻，置于搖床上（300 r/min）振蕩反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，離心洗滌，棄上層清液，加入無水乙醇重新溶解后再重復(fù)離心洗滌，直至上層清液在490 nm處無紫外吸收峰。

1.3 表征方法

采用美國FEI公司Tecnai G2F20S-TWIN型透射電子顯微鏡觀察納米顆粒形貌，加速電壓200 kV；采用日本Rigaku公司D/max 2200PC型X射線衍射分析儀對納米顆粒晶體類型進行分析，Cu Kα射線，掃描范圍10°～80°；采用德國Bruker光譜儀器公司Tensor 27型紅外光譜儀測定吸收峰，溴化鉀壓片，掃描范圍500～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1；室溫下將磁性納米顆粒置于思普特公司SPT-VSM-130型振動磁強計上測定試樣的磁滯回線，最大磁場強度6×103A/m；采用德國耐馳公司STA409C型熱分析儀作熱重分析，載氣N2，升溫速率10 ℃/min，最高溫度800 ℃；采用英國馬爾文公司Mastersizer 3000型馬爾文動態(tài)光散射激光粒度儀測定不同pH下試樣的Zeta電位，納米顆粒溶液pH用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)，pH范圍為2～13。

2 結(jié)果與討論

2.1 油相Fe3O4納米顆粒表征結(jié)果

2.1.1 形貌及結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

圖1為4 nm油相Fe3O4納米顆粒TEM照片及粒徑分布。由圖1可知，油相Fe3O4納米顆粒呈球形，具有單分散性。圖2為4 nm油相Fe3O4納米顆粒XRD譜圖。由圖2可知，制備的Fe3O4納米顆粒具有立方尖晶石結(jié)構(gòu)。

2.1.2 VSM表征結(jié)果

圖3為油相Fe3O4納米顆粒的磁滯回線。由圖3可知，納米顆粒在300 kHz時沒有剩余磁場和矯頑力，說明納米顆粒具有超順磁特性。飽和磁化強度為53×103A/（m·g），明顯低于油相Fe3O4體相的飽和磁化強度，可能是油相Fe3O4納米顆粒表面覆蓋了一層油酸的緣故［14］。

圖1 4 nm油相Fe3O4納米顆粒TEM照片及粒徑分布Fig.1 TEM photograph and size distribution of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

圖2 4 nm油相Fe3O4納米顆粒的XRD譜圖Fig.2 XRD spectrum of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

圖3 4 nm油相Fe3O4納米顆粒的磁滯回線Fig.3 Hysteresis curve of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

2.1.3 FTIR表征結(jié)果

圖4為油相Fe3O4納米顆粒FTIR譜圖。由圖4可知，在2 929 cm-1和2 856 cm-1處為亞甲基—CH2—的不對稱和對稱振動吸收峰；在1 426 cm-1處為C==O鍵的對稱伸縮振動峰，表明油酸分子中的羧基在Fe3O4納米顆粒表面與Fe原子結(jié)合形成了共價鍵。

2.1.4 TG表征結(jié)果

圖5為4 nm油相Fe3O4納米顆粒的TG曲線。由圖5可知，曲線出現(xiàn)兩個失重階段，第一個階段在100～300 ℃，主要是Fe3O4納米顆粒孔隙吸附水和結(jié)構(gòu)水的脫除；第二個階段在300～600 ℃，在此階段納米顆粒失重率有明顯下降，這是由于納米顆粒表面的油酸逐漸脫除，加熱到600 ℃時，失重率達到38%。溫度高于600 ℃時，質(zhì)量維持恒定，說明表面油酸脫除完全。

圖4 4 nm油相Fe3O4納米顆粒的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectrum of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

圖5 4 nm油相Fe3O4納米顆粒的TG曲線Fig.5 TG curve of 4 nm Fe3O4 nanoparticles in oil phase.

2.2 表面修飾Fe3O4納米顆粒的表征結(jié)果

2.2.1 粒徑分布

圖6為4 nm油相Fe3O4納米顆粒經(jīng)表面修飾后的粒徑分布。由圖6可知，經(jīng)PEI包覆油相納米顆粒后對應(yīng)的水合直徑為10.9 nm，F(xiàn)e3O4-PEI納米顆粒經(jīng)FITC修飾后水合直徑變?yōu)?8.8 nm，粒徑隨著水相納米顆粒尺寸增大而增大，且尺寸分布較窄，說明經(jīng)一系列表面修飾后納米顆粒沒有出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，在水相中均勻分散。

圖6 納米顆粒經(jīng)表面修飾后的粒徑分布Fig.6 Size distribution of surface modified nanoparticles.PEI：polyethyleneimine；FITC：fluorescein isothiocyanate.

2.2.2 Zeta電位

由于靜電斥力作用，F(xiàn)e3O4納米顆粒在水溶液中Zeta電位（絕對值）越大，溶液越趨于穩(wěn)定狀態(tài)，納米顆粒在溶液中分散越均勻。PEI分子中含有大量的氨基，經(jīng)PEI包覆油相納米顆粒后，溶液中形成NH3+，使得納米顆粒表面帶正電荷，水相納米顆粒對應(yīng)的等電點為10.3。圖7為4 nm油相Fe3O4納米顆粒經(jīng)表面修飾后的Zeta電位。

圖7 納米顆粒經(jīng)表面修飾后的Zeta電位Fig.7 Zeta-potentials of surface modified nanoparticles.

由圖7可知，在pH=7時，PEI對應(yīng)的Zeta電位為24.6 mV，表明Fe3O4-PEI納米顆粒水溶液在中性條件下較穩(wěn)定。FITC修飾水相Fe3O4-PEI納米顆粒，對應(yīng)的等電點為8.9，等電點相對降低，說明PEI分子表面氨基與FITC反應(yīng)，納米顆粒表面所帶正電荷減少。在pH=7時，對應(yīng)的Zeta電位為15.7 mV，表明經(jīng)FITC修飾后的水相Fe3O4-PEI納米顆粒在中性條件下也較穩(wěn)定。

2.2.3 FTIR表征結(jié)果

圖8為Fe3O4-PEI和Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的FTIR譜圖。由圖8可知，F(xiàn)e3O4-PEI譜線在1 638 cm-1處的特征吸收峰歸屬于C—N鍵的伸縮振動，在3 385 cm-1處的特征吸收峰歸屬于N—H鍵的伸縮振動，在1 157 cm-1和1 108 cm-1處的特征吸收峰分別歸屬于 NH2和NH的不對稱振動吸收，說明存在伯氨基，即PEI分子成功包覆在Fe3O4納米顆粒表面；Fe3O4-PEI-FITC曲線在1 630 cm-1處出現(xiàn)了酰胺鍵的特征吸收峰，說明PEI分子上的伯氨基和FITC發(fā)生反應(yīng)，F(xiàn)ITC熒光分子成功接枝于納米顆粒表面。

圖8 納米顆粒經(jīng)表面修飾后的FTIR譜圖Fig.8 FTIR spectra of surface modified nanoparticles.

2.2.4 Fe3O4-PEI-FITC 納米顆粒熒光穩(wěn)定性分析

圖9為Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒水溶液的熒光強度。

圖9 Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的熒光穩(wěn)定性Fig.9 Fluorescent stability of Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

由圖9可知，經(jīng)表面熒光修飾后的Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒沒有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象發(fā)生，穩(wěn)定性較好。表明Fe3O4納米顆粒經(jīng)PEI包覆后，阻止了熒光分子與Fe3O4納米顆粒內(nèi)核相結(jié)合，極大程度降低了Fe3O4納米顆粒內(nèi)核帶來的熒光猝滅現(xiàn)象發(fā)生。

2.2.5 Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒VSM表征結(jié)果

圖10為Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的磁滯回線。由圖10可知，F(xiàn)e3O4-PEI-FITC納米顆粒的飽和磁化強度為42×103A/（m·g），小于油相納米顆粒的飽和磁化強度53×103A/（m·g）。但納米顆粒在300 kHz時沒有剩磁和矯頑力，納米顆粒仍具有超順磁特性。

圖10 Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的磁滯回線Fig.10 Hysteresis curve of Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

2.3 磁性熒光Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒MR成像研究

2.3.1 細(xì)胞毒性分析

采用四唑鹽比色法來探究經(jīng)PEI和FITC修飾后Fe3O4納米顆粒的細(xì)胞相容性。對于Fe3O4納米顆粒，隨著Fe離子含量的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，但經(jīng)修飾后的Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的細(xì)胞存活率仍在83%以上，即使當(dāng)Fe離子含量達180 μg/mL，細(xì)胞增值仍受較小影響。表明經(jīng)PEI和FITC修飾后的Fe3O4納米顆粒細(xì)胞相容性較好。

2.3.2 弛豫率及MR成像分析

Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒的內(nèi)核尺寸大小影響縱向弛豫時間（t1）及橫向弛豫時間（t2），從而使MR信號強弱受到影響。縱向弛豫率（r1）及橫向弛豫率（r2）可分別通過不同F(xiàn)e含量的Fe3O4納米顆粒的t1，t2的倒數(shù)擬合得到［15］，r1和r2的大小直接反應(yīng)出納米顆粒作為T1和T2造影劑的潛力。

圖11為Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒Fe含量與1/t1、1/t2的線性關(guān)系。由圖11可知，F(xiàn)e3O4-PEIFITC納米顆粒的1/t1，1/t2與Fe含量均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。通過計算可得水動力學(xué)直徑為18.8 nm的Fe3O4納米顆粒的r1= 7.96 m/ms，r2= 25.83 m/ms。結(jié)合Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒對應(yīng)的T1，T2加權(quán)MR成像圖分析，F(xiàn)e3O4-PEI-FITC納米顆粒（內(nèi)核尺寸為4 nm）的T1加權(quán)MR成像圖有較為明顯的逐漸變亮趨勢，MR成像信號增強，但T2加權(quán)MR成像圖變暗趨勢不明顯。因此，表面修飾后的水動力學(xué)直徑為18.8 nm的Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒更適合作為T1造影劑。

圖11 Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒Fe含量與1/t1、1/t2的線性關(guān)系Fig.11 Linear relationship of the Fe3O4-PEI-FITC nanoparticles Fe content to 1/t1 and 1/t2 .t1：longitudinal relaxation time；t2：transverse relaxation time；r1：longitudinal relaxation rate；r2：transverse relaxation rate.The hydrodynamic diameter of the nanoparticles is 18.8 nm.

3 結(jié)論

1）制備的4 nm油相Fe3O4納米顆粒表面成功包覆了油酸分子，納米顆粒單分散性較好，顆粒大小均勻且呈球形，具有立方尖晶石結(jié)構(gòu)。在室溫下無剩磁和矯頑力且具有超順磁特性。

2）經(jīng)PEI及FITC功能化修飾后的Fe3O4納米顆粒，水動力學(xué)直徑增大，顆粒尺寸分布較窄；在中性條件下，可在水相中均勻、穩(wěn)定存在，飽和磁化強度降低，但仍具有超順磁特性，熒光穩(wěn)定性較好，沒有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象。

3）磁性熒光Fe3O4-PEI-FITC納米顆粒具有良好的細(xì)胞相容性；擬合計算可得納米顆粒的r1=7.96 m/ms，r2= 25.83 m/ms；結(jié)合MR加權(quán)成像圖分析，該納米顆粒適合應(yīng)用于T1造影劑。

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