25%四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷模型血清AST、ALT水平變化*

杜 斌，蔡維維，陳俊良，侯 豹，邱麗穎△（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫141；.江南大學無錫醫學院，江蘇無錫141）

采用四氯化碳（CCl4）誘導急性肝損傷模型，實驗后檢測谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）中任意一項指標和肝臟組織病理學診斷結果為陽性，方可診斷為有效[1]。肝臟組織病理學診斷為有創損傷，因此具有一定的局限性。在臨床診斷中，以AST、ALT等肝功能指標檢測和結合臨床癥狀為主。在研發和申報對化學性肝損傷具有保護作用的藥物及具有輔助性保護功能的保健食品時常采用實驗大鼠或小鼠CCl4肝損傷模型作為檢驗方法。CCl4是誘導急性肝損傷模型的經典藥物，不同劑量CCl4誘導急性肝損傷模型的病程和轉歸具有較大差異[2?6]。所以，本研究采用 25%CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型，觀察急性肝損傷小鼠血清AST、ALT水平變化，旨在為急性肝損傷模型的建立提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 CCl4、橄欖油、戊巴比妥鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司，AST、ALT檢測試劑均購自桂林優利特醫療電子有限公司。

圖1 各組小鼠肝臟形態肉眼觀察

1.1.2 動物及實驗儀器 56只癌癥研究所的小鼠（雄性）由浙江省實驗動物中心提供，體重（20.0±2.0）g；全自動生化分析儀（URIT?8260）購自桂林優利特醫療電子有限公司；臺式高速冷凍離心機（5427R）購自德國艾本德公司；單道移液器購自德國艾本德公司；電子天平（XPE105）購自梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷模型建立及分組 將56只雄性小鼠隨機（根據小鼠體重由低至高排序，確保每組小鼠體重相對均一）分為正常組和給藥 3、6、12、24、48、72 h組，每組8只。CCl4和橄欖油根據體積比混合，配置成25%CCl4溶液，腹腔注射給藥0.05 mL/10 g。正常組給予同體積橄欖油。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 肉眼觀察 正常組和給藥3、6、12、24、48、72 h組小鼠眼球內眥靜脈叢取血，放血處死。打開腹腔，迅速取出肝臟。肉眼觀察肝臟形態變化。

1.2.2.2 生化指標測定 對各組小鼠眼球內眥靜脈叢取血、分離血清。根據試劑盒及全自動生化分析儀使用要求檢測血清ALT、AST水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝臟形態肉眼觀察 正常組小鼠肝臟薄膜光滑，顏色呈褐紅色；給藥組小鼠肝臟薄膜無光澤，顏色呈褐黃色，肝臟表面有顆粒狀樣變。給藥組小鼠不同時間點肝臟肉眼觀察無明顯改變，見圖1。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST水平比較 給藥組小鼠血清ALT、AST水平與正常組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；給藥 48 h組小鼠血清 ALT、AST 水平與給藥72 h組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。給藥6 h組小鼠血清AST水平明顯升高，12 h達到峰值，且24、48、72 h維持較高水平；給藥3 h組小鼠血清ALT水平明顯升高，24 h達到峰值，48、72 h維持較高水平，見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（±s，U/L）

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平比較（±s，U/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與給藥 48、72 h 組比較，bP＜0.05

組別 n正常組 8給藥3 h組 8給藥6 h組 8給藥12 h組 8給藥24 h組 8給藥48 h組 8給藥72 h組 8 AST 48.0±12.6 174.7±21.8a 542.0±59.1ab 573.0±45.6ab 495.7±8.7a 477.8±44.8a 445.3±75.8a ALT 130.4±24.8 407.7±65.4ab 415.9±63.3ab 445.3±51.1ab 1 150.8±106.7ab 967.5±124.9a 825.2±92.2a

3 討 論

肝臟是人體最大的消化腺體，也是人體主要的代謝和防御器官。肝臟疾病是影響人類健康的最為常見疾病之一，對肝臟疾病的防治已為全世界所關注的問題。

CCl4通過細胞色素P450系統的生物轉化，CCl4能產生高反應性三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由基，從而誘發肝損傷[7]。CCl4誘導肝損傷動物模型的肝細胞病理學特征與人類病毒性肝炎極為相似[8]。CCl4誘導肝損傷模型一直是篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一[9]。

AST主要分布于肝細胞的線粒體和細胞質中，ALT主要分布于肝細胞質中。正常情況下二者只有極少量釋放入血液，當肝組織受到急性損傷或細胞膜通透性增加時這2種酶大量釋放到血液中，使血清中酶的水平顯著升高，1%肝細胞損傷時ALT水平即升高1倍[10]。ALT、AST升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[11?13]。按肝損傷程度可分為可逆性肝損傷和非可逆性肝損傷。

CCl4的染毒劑量和持續接觸時間是影響其肝毒性的重要因素[5，14]。CCl4染毒小鼠肝損傷過重，肝細胞變性、壞死，自身修復能力受到嚴重影響[15]。

本研究旨在為CCl4選擇一種短時、高效的劑量，同時能反映肝臟的自我修復和損傷的病理生理過程。采用單次腹腔注射25%CCl4橄欖油溶液，誘導不同時間點急性肝損傷模型。結果顯示，給藥后72 h組小鼠死亡率為0。肉眼觀察CCl4誘導急性肝損傷的肝臟表面呈顆粒狀樣變。25%CCl4誘導急性肝損傷模型血清AST水平6 h顯著升高，12 h達到峰值，24、48、72 h維持較高水平；血清ALT水平較3 h顯著升高，24 h達到峰值，48、72 h維持較高水平。因此，24 h前肝損傷處于進展期，24 h后血清AST、ALT水平均較為平穩。因此，選擇48 h或72 h為肝臟取材時間點進行血清AST、ALT水平檢測，更有利于篩選具有保肝降酶作用的藥物。

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