特異性透明質酸酶的研究進展

[摘要]透明質酸酶在臨床上被用作藥物擴散劑，它通過降解腫瘤微環境和皮膚組織中的透明質酸，從而提高組織的通透性來促進藥物的擴散和吸收，在腫瘤治療和皮下給藥中都有很好的應用前景。透明質酸酶對細胞外基質中透明質酸的降解作用不僅與其對透明質酸的解聚作用效力有關，還與酶的底物特異性有關。近年來，不斷有專一性降解透明質酸的透明質酸酶被發現，本文主要對目前發現的特異性透明質酸酶的研究現狀作一綜述。

[關鍵詞]透明質酸葡糖胺酶;底物特異性;綜述

[中圖分類號]R345[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2018）06-0750-04

透明質酸酶是一類能夠降解透明質酸的酶的總稱，1929年首次被DURAN-REYNALS發現時稱為“擴散因子”[1]，它可以使皮下注射的疫苗、毒素等更好地擴散。1940年，該酶被MEYER等[2]正式命名為透明質酸酶。此后，在多種生物體內以及人體的多種組織中陸續發現了透明質酸酶。該酶在細菌中普遍存在，革蘭陽性菌產生的透明質酸酶主要存在于細胞莢膜中，革蘭陰性菌產生的透明質酸酶一般存在于細胞周質中。此外，在真菌以及非脊椎動物如水蛭、甲殼類動物的體內同樣發現了透明質酸酶的存在。近年來，不斷有專一性降解透明質酸的透明質酸酶被發現，由于其良好的生物學活性受到更多研究者的關注。本文主要對目前發現的特異性透明質酸酶的研究現狀作一綜述。

1透明質酸酶

1.1透明質酸酶的生物學活性

透明質酸酶的生物學活性很多，它作為藥物擴散劑，在眼科手術方面有一定的應用[3]。透明質酸酶作為工具酶能夠快速降解透明質酸，可以用來制備低分子透明質酸和透明質酸寡糖[4]。透明質酸酶與注射液合用可以消除血腫或水腫，通過對透明質酸的解聚作用，促進局部積貯的血液、滲出液或注射液的快速擴散和吸收[5-7]。在抗腫瘤藥物的使用方面，局部注射透明質酸酶能夠有效防止紫杉醇外滲性損傷的發生[8]。此外，在整形美容領域，透明質酸酶也常被用于面部注射透明質酸除皺后不良反應的后處理[9]。

1.2透明質酸酶的分類

依據透明質酸酶序列同源性之間的關系，透明質酸酶可分為真核生物來源透明質酸酶和原核生物來源透明質酸酶兩個大類。來源于動物和人（例如睪丸、精子、皮膚、蛇毒和水蛭等）的真核生物透明質酸酶屬于水解酶，主要是從動物組織中提取的，應用最廣泛的是牛睪丸透明質酸酶。2005年12月，FDA批準重組人類透明質酸酶注射劑作為其他注射藥物的輔助藥物。商品化的重組人透明質酸酶在醫藥領域有一定應用，其氨基酸序列是PH20[10]。PH20除能夠降解透明質酸外還能夠微弱地降解硫酸軟骨素-A，但不降解硫酸軟骨素-B和硫酸軟骨素-C，而牛睪丸透明質酸酶對這些底物均有不同程度的降解作用[11]。原核生物來源（例如溶血鏈球菌、金黃色葡萄球菌和氣單胞菌等）的透明質酸酶屬于裂解酶。這些透明質酸酶大多數除了可以降解透明質酸外，還能降解其他種類的糖胺聚糖（例如軟骨素和硫酸軟骨素等），可通過篩選產透明質酸酶的菌株并從其發酵液或菌體細胞中分離到。

2特異性透明質酸酶

2.1水蛭透明質酸酶

水蛭透明質酸酶首次被發現是在1937年，CLAUDE[12]在水蛭提取液中發現了這種“擴散因子”，后來被證實為水蛭透明質酸酶。分離純化后研究其酶學性質發現，水蛭透明質酸酶能夠特異性降解透明質酸，不降解除了透明質酸以外的黏多糖，屬于水解酶，作用于β-1，3糖苷鍵，降解的主產物是飽和透明質酸四糖[13]。水蛭透明質酸酶的最適反應溫度是38 ℃，最適反應pH值為5.5，在50 ℃以下穩定[14]。2014年，JIN等[15]采用隨機引物擴增的方法從水蛭的全基因組中擴增到第一個水蛭透明質酸酶的基因，通過蛋白質工程技術和高密度發酵，成功在畢赤酵母表達系統里實現了水蛭透明質酸酶的高產，酶活力達到8.42×108U/L。2015年，KANG等[16]對重組水蛭透明質酸酶在畢赤酵母中的發酵條件進行優化，將酶活力從8.42×108U/L提升到1.24×109U/L。

早在1941年，HIRST[17]就證實水蛭透明質酸酶具有很強的抗菌性能。此外，水蛭透明質酸酶具有與其他哺乳動物透明質酸酶類似的活性，能夠促進藥物擴散，在青光眼等眼科手術中具有很好的治療效果[18]。2016年，LV等[19]利用高效液相色譜和質譜對水蛭透明質酸酶降解透明質酸的終產物進行分析，清楚地展示了終產物中四糖和六糖的比例，并獲得了大量的透明質酸四糖。與其他的一些寡糖（平均分子量4 000）相比，透明質酸四糖和六糖在促進血管生成方面顯示出高的生物學活性，這與牛睪丸透明質酸酶產生的四糖和六糖的作用效果相似。這種由水蛭透明質酸酶降解產生的高純度透明質酸四糖和六糖將會吸引很多科學家的興趣，并有很大的潛在應用價值。

2.2動物毒液透明質酸酶

許多動物如蛇、蜥蜴、蜜蜂、蜘蛛等的毒液中都發現了透明質酸酶的存在[20]。大部分動物毒液透明質酸酶不僅能夠降解透明質酸，還能以其他糖胺聚糖如軟骨素和硫酸軟骨素等作為底物[21-22]。2004年，GIRISH等[23]在眼鏡蛇毒液中發現了對透明質酸絕對特異性降解的動物毒液透明質酸酶，該酶分子量為70 406，屬于中性活性的酶，其降解主產物是飽和透明質酸四糖。該酶切割β-1，4-糖苷鍵，屬于內切-β-N-乙酰氨基己糖苷酶。隨后在蜘蛛毒液、蛇毒液等動物毒液中均發現了這種專一性降解透明質酸的透明質酸酶。2007年，NAGARAJU等[24]從蜘蛛毒液中分離純化到底物專一性動物毒液透明質酸酶，該酶的分子量為42 260，最適反應溫度為37 ℃，最適pH值為5.8，屬于中性活性的酶，在反應中存在300 mmol/L NaCl時活性最高。2012年，WABBY等[25]在最危險的埃及角蝰毒液中分離到一種新型透明質酸酶CcHaseⅡ，該酶分子量為33 000，最適反應溫度為37 ℃，最適pH值為5.5，同樣Na+對酶活性有促進作用。

動物毒液是酶和蛋白質的混合物，透明質酸酶是其重要的組成成分，在促進毒素擴散方面起到至關重要的作用。蜜蜂毒液、蝎子毒液等中的透明質酸酶是使人體產生IgE介導的致命過敏反應的過敏原[26]。動物毒液透明質酸酶的結構和作用機制研究具有重要臨床意義，能夠為毒液螫入人體產生病理學反應提供治療依據，同時可以進一步研究有價值的無毒透明質酸酶抑制劑，將其作為急救藥物對被釋放毒液動物咬傷的人員進行緊急救治。

2.3微生物來源底物專一性透明質酸酶

原核生物來源的透明質酸酶又稱為透明質酸裂解酶，能產生透明質酸裂解酶的微生物種類有很多。微生物來源的透明質酸酶屬于多糖裂解酶第8、16家族。有些噬菌體也能產生透明質酸酶，但是其分子量遠小于細菌透明質酸酶，而且在胞外環境下測得的活性很低[27]。這些透明質酸酶大多數不具有底物特異性，還能降解軟骨素和硫酸軟骨素。但是來源于鏈霉菌的透明質酸裂解酶具有很強的底物特異性，能夠專一性降解透明質酸[11]。某些細菌的噬菌體也能產生專一性降解透明質酸的透明質酸酶。目前，微生物來源的透明質酸酶僅在革蘭陽性菌（鏈霉菌）和噬菌體中發現了這種底物特異性透明質酸酶。

2.3.1鏈霉菌透明質酸裂解酶鏈霉菌透明質酸酶在1970年被OHYA等[28]首次發現，由于其特殊的底物特異性吸引了很多學者進行研究。后續研究發現，該酶與已知微生物來源的透明質酸酶在作用機制和最終降解產物上是不同的，其他種類微生物來源的透明質酸酶降解透明質酸的終產物是不飽和二糖，而鏈霉菌透明質酸酶降解透明質酸的主產物則是不飽和四糖和六糖[29]，不能降解產生二糖。雖然其降解機制也是通過β-消除反應進行，但它不是進行性降解，而是采用隨機內切的方式。2015年，PAVAN等[11]從Streptomyces koganeiensis鏈霉菌中獲得了重組的鏈霉菌透明質酸酶rHyal_Sk，該酶分子量為21 600。rHyal_Sk是一種高度專一性降解透明質酸的原核生物透明質酸酶，而且硫酸化的透明質酸和硫酸軟骨素對其活性沒有任何抑制作用，體內和體外實驗均證明rHyal_Sk具有很好的擴散作用，是一種新型“擴散因子”。

2.3.2噬菌體透明質酸酶鏈球菌透明質酸酶（如無乳鏈球菌、中心鏈球菌和停乳鏈球菌透明質酸酶等）可以非特異性地降解一種黏多糖，并且通常能夠作用于透明質酸和硫酸軟骨素[30]。然而，寄生于鏈球菌的噬菌體產生的透明質酸酶卻對底物具有強烈的專一性，只能降解透明質酸，它們利用合成的透明質酸酶依附于透明質酸豐富的細菌膜表面。

目前發現的噬菌體透明質酸酶并不多，有報道的產透明質酸酶的噬菌體只有釀膿鏈球菌10403[31]、H4489A[32]和馬疫鏈球菌前噬菌體7047[33]。1997年，BAKER等[30]發現釀膿鏈球菌噬菌體透明質酸酶專一性降解透明質酸，對其他種類糖胺聚糖都沒有降解作用，屬于裂解酶，但其降解方式不是進行性降解，降解的主產物是不飽和四糖和六糖。2006年，MISHRA等[31]闡明了釀膿鏈球菌10403中的噬菌體透明質酸酶HylP2底物特異性的影響因素，HylP2 C末端的結構域是催化結構域，而且僅有C端本身也能催化反應的進行，但是僅有C端的HylP2不僅能夠降解透明質酸，還能夠以硫酸軟骨素作為底物，C端結構域和N端之間特殊的相互作用可能是實現噬菌體透明質酸酶最大酶活力和底物特異性所必需的。該研究首次詳細地說明了蛋白質結構與噬菌體透明質酸裂解酶功能之間的關系。

3展望

透明質酸酶的生物學活性很多，重要的應用領域之一是在經皮給藥中的應用。經皮給藥安全性高、易操作，可作為靜脈給藥的替代或備選方案。研究證明，透明質酸酶對細胞外基質中透明質酸的降解作用不僅與其對透明質酸的解聚作用效力有關，還與其空間位阻、催化機制和酶的底物特異性有關，因此這些底物特異性透明質酸酶可能在經皮給藥促進藥物擴散方面具有更為重要的應用，篩選新型底物特異性透明質酸酶將會成為今后研究透明質酸酶一個重要方向。底物特異性透明質酸酶的研究將為預防和治療透明質酸酶相關疾病提供新的途徑和理論依據。

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