甘薯莖尖脫毒組培快繁技術研究

甘薯是我國重要的農作物之一，年產量僅次于水稻、小麥和玉米。甘薯以其甘甜可口的特點深得人們的喜愛。此外，甘薯很容易種植，選擇水分大、不過于貧瘠的地方插入薯苗即可。因甘薯抗逆性強、用途廣等優良品質，在未來很有可能作為一種能源物質用于乙醇的生產。

然而，病毒病卻一直影響著甘薯的產量，極大地阻礙了甘薯的生產，中國每年因甘薯病毒病造成的產量損失價值高達40億元。

當前防治甘薯病毒病的方法通常是剝離莖尖分生組織，離體培養后得到脫毒苗來去除病毒，然后進行培育、快繁，將脫毒種薯應用于大規模的農業生產上。多年來，世界上各個國家的科研人士致力于甘薯脫毒培養技術的研究，以尋求防治甘薯病毒病的最有效的方法，但由于病毒種類多、變異快，很難徹底杜絕甘薯病毒的存在。然而，莖尖分生組織脫毒培養技術為有效防治甘薯病毒病開辟了一片新天地，是目前獲取和培養脫毒苗的最常用的手段。經脫毒后的甘薯能恢復其品種原始的優良性狀，采用快速繁殖技術將甘薯這些優良品質遺傳下去，以達到提高甘薯產量和質量的目的。該研究以商薯19莖尖為外植體，經過愈傷誘導、分化、增殖和生根培養，建立甘薯莖尖脫毒組培快繁技術，為生產優良高質量的甘薯組培脫毒苗提供理論依據。

一、材料與方法

（一）材料

本研究所用的商薯19植株來自鄭州師范學院生物工程研究所。

（二）方法

1.無菌芽的獲得。選取健康無病斑的商薯塊，洗凈泥土，用1%高錳酸鉀處理15 min，0.5%多菌靈浸泡1 h后撈出晾干，置于滅菌水中（0.1%的多菌靈）恒溫（28 ℃）催芽，相對濕度80%～85%。薯芽萌發后，于35～40 ℃（8 h/d）下處理30天。當薯芽長至10 cm時，用已消毒的解剖刀切下頂部約3 cm芽段，剪去已經伸展的葉片，放入燒杯中進行表面消毒，利用3種不同消毒方法（見表1）進行消毒，再用已消毒的紗布吸干芽段外表的水分，置于無菌環境（超凈工作臺上）。

2.莖尖培養。切取莖尖頂端約1 cm長芽段，用已消毒的解剖刀在40倍解剖鏡下切除較大的葉原基，用解剖針切下位于莖尖頂端的生長點（生長點為扁平透明的突起）。切下后，用解剖針將莖尖頂端的生長點挑到裝有培養基的培養皿中進行莖尖誘導，每個培養皿中接種數量一致（3～4個）。分別用3種培養基進行培養，編號A1、A2、A3，所用培養基及生長狀況（見表2）。

3.苗的增殖。莖尖15天后可分化出苗，然后可進行增殖培養。此時，需從培養皿中將苗移植到培養瓶中，此過程應注意保持無菌環境，避免污染，同時注意避免損傷苗的莖和葉。分別用3種不同培養基同時進行培養，編號B4、B5、B6，每個培養瓶中接種的數量一致（3～5個），所用培養基及增殖狀況（見表3）。

4.脫毒苗根的誘導。脫毒苗快速繁殖可利用單莖葉來進行，即在無菌條件下（在超凈工作臺上進行），將莖尖苗剪切成小的莖段，每個莖段帶1節和1片葉，然后用鑷子將單莖葉的形態學下端扦插于培養基中，此過程容易污染，鑷子及解剖刀應進行頻繁消毒。然后加入生長調節劑來誘導單莖葉生根，側芽向上生長，得到一棵完整的植株。根的誘導也分為3組同時進行，編號C7、C8、C9，每組所用培養基配比不同，所用培養基及根的誘導情況（見表4）。

5.培養條件。所有培養基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂9 g/L，pH值5.8～6.0，120 ℃滅菌30 min，所有的培養溫度均為（24±2）℃，光照2500～3000 lx，光照時間為12 h/d。

二、結果與分析

（一）不同表面消毒方法對莖尖成活率的影響

由表1可知，外植體以處理A效果最佳，處理B效果次之，處理C效果最差?？梢娚臏缇Ч却温人徕c好，從處理A和處理B對比不難得出，0.1%升汞滅菌的時間長短對莖尖成活率也有一定的影響。綜合不同滅菌方法的效果來看，最佳選擇是處理A。

（二）莖尖誘導

外植體莖段接種15天后觀察其生長狀況，在加入6-BA和NAA組合的培養基中，無菌芽伸長快，高度正常，并且芽呈綠色（見圖1）；在加入KT的培養基中，無菌芽伸長快，植株較高，芽黃綠色，說明KT的加入，莖尖誘導的效果不好；在不加入激素的MS培養基中，無菌芽伸長慢，植株高度不正常，芽黃綠色，說明莖尖誘導需要加入一定量的激素，莖尖誘導的培養基最佳選擇為A1號（見表2）。

（三）苗的增殖

莖尖15天后可分化出苗（見圖2），30天后可增殖6～7片葉 （見圖3） 。從3種培養基的苗增殖情況可看出，6-BA可有效誘導苗的增殖，但較低濃度的效果不佳，6-BA與CW的組合效果最佳；6-BA與NAA的組合不利于葉的生長。綜合3種培養基中苗的長勢來看，適宜增殖的最佳培養基為B4號，苗生長快、健壯，葉大而綠（見表3）。

（四）生根培養

用已消毒的鑷子將單莖葉的形態學下端扦插于培養基中，通過生長調節劑的作用誘導單莖葉生根，側芽向上生長，形成一棵完整的植株（見圖4）。試驗表明，NAA有利于單莖葉的誘導生根，濃度稍高的NAA效果更好。綜合三種不同培養基中多數幼苗的生根情況來看，誘導生根培養基的最佳選擇為C7號，生根多而且健壯，有利于后期整棵植株的營養供應（見表4）。

三、討論

莖尖分生組織培養技術是當前獲取和培養脫毒苗的主要手段。本研究以商薯的莖尖為外植體，初步建立了甘薯的脫毒苗組培快繁體系。由于本試驗選取的研究對象是商薯19，因此，本試驗所建立脫毒苗快繁體系不一定完全適應其他品種的甘薯。在實踐中，可根據事實情況酌情變動培養基的配比。

試驗表明：在商薯莖尖表面消毒過程中，通過本試驗發現，以0.1%的升汞滅菌6～7 min為宜，低于6 min外植體容易發生不同程度的污染，高于7 min外植體容易死亡，0.1%的升汞滅菌效果好于10%的次氯酸鈉。由于升汞對人體及環境有害，使用過的升汞應做特殊處理，不能隨意丟棄。

脫毒苗快速繁殖技術的關鍵在于剝離的莖尖組織的誘導分化，在培養基中加入適量的6-BA和NAA有利于芽的誘導分化，但要注意濃度大小應適中，過高或過低不僅不能誘導分化，反而起抑制作用。

在商薯苗的增殖培養階段，在培養基中加入適量的CW有利于苗的生長。但是要注意CW的濃度及用量，過高或過低都不能起到促進苗增殖的作用。脫毒苗快速繁殖利用單莖葉來進行，MS培養基和1/2 mS培養基是適合商薯生根的基本培養基，在培養基中加入適量的NAA有利于單莖葉的誘導生根，并且生出的根粗壯，有利于后期成苗的營養吸收。

配制培養基時，注意培養瓶封口的工作及培養基滅菌程序，避免污染培養基，影響商薯器官組織的成活率。此外，要注意培養基中添加的蔗糖和瓊脂的濃度，以及誘導愈傷組織形成器官時的光照和溫度，總之，要盡量給予商薯各組織器官生長的最適條件。

在將莖尖分化出的苗從培養皿移植到培養瓶中時，要注意輕輕夾取，避免用力過度而損傷莖和葉。同時試驗要在酒精燈旁操作，避免空氣中的細菌污染培養基及莖尖分化組織。此外，操作時動作要快，避免酒精燈熱量灼傷莖尖分化組織。

在剝離莖尖組織及切取單莖葉時，多次用到解剖刀、解剖針及鑷子，注意每次使用前后都要進行頻繁的高溫消毒，避免污染商薯莖尖分生組織及單莖葉等，影響脫毒的成功率。此外，經高溫消毒的鑷子、解剖刀和解剖針要冷卻后再使用，避免燙傷商薯幼苗的器官組織，影響成活率。