大鼠血清外泌體對MCF-7細胞自噬的影響

陳 奇，徐 彬，毛建文*

（1．廣東藥科大學基礎學院，廣東 廣州 510006；2．廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006）

1963年，比利時的細胞學家克里斯汀德迪夫率先提出了一個術語“自噬”，即一種由細胞自身調控的毀滅機制，用來降解無用或功能失調的組份[1]。大隅良典于90年代闡明了細胞自噬的機制，研究者們直至此時才發現自噬在人體中的重要作用[2]。外泌體是一種細胞來源的囊泡，存在于許多乃至所有真核生物的體液中，包括血液、尿液以及細胞培養的培養液中[3-4]。幾乎所有類型的細胞都通過自噬克服饑餓、回收養分以及將多余的或有害的成分轉運至細胞外。同時外泌體能夠在細胞間傳遞，因此在某些情況下這一轉運過程是通過外泌體進行的[5]。目前關于血清外泌體的研究大多集中于作為新的生物標志物用于活體檢驗方面，對于血清外泌體與腫瘤及自噬之間的研究較少。本研究觀察了大鼠正常血清外泌體對乳腺癌（MCF-7）細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

人乳腺癌細胞株MCF-7；高糖DMEM培養基；四季青胎牛血清；胰島素（Sigma公司）；胰酶；雷帕霉素（Rapamycin）；CCK-8試劑盒、LC3B抗體、GAPDH抗體、鼠抗、兔抗（碧云天公司）；脫脂奶粉

1.2 細胞培養及血清外泌體提取及鑒定

MCF-7細胞用DMEM培養液（含10 %胎牛血清、0.01 mg/ml胰島素）培養。培養條件為37℃、5%CO2。取1 ml正常SD大鼠血清，試劑盒法提取，用PBS重懸至200 μl，加入DMEM（含10%FBS）培養液，配置成每100 μl培養液含10 μl外泌體，0.22 μm微孔濾膜過濾。對所提取的血清外泌體采用透射電鏡檢測其形態特征，采用WB法鑒定特征性蛋白質。

1.3 血清外泌體對MCF-7細胞存活率的影響觀察

取對數生長期的MCF-7細胞，PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化，按4×104個/孔接種于96孔細胞培養板，分為Control、雷帕霉素（Rapa）、外泌體（Exo）、Exo+Rapa組，每組設3個平行復孔。Control組不加任何藥物培養；Rapa組加入30nM Rapa，作用24 h；Exo組加入過濾后的含10%外泌體的培養液，培養48 h；Exo+Rapa組先加入含10%外泌體的培養液，培養48 h，然后加入30 nM Rapa，作用24 h。處理結束后使用CCK-8試劑盒，孵育1 h，檢測450 nm波長處的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均值。

1.4 MCF-7細胞LC3B的熒光檢測

細胞分組同1.3。吸棄培養基，PBS洗3次，固定15 min。去除固定液，洗滌后加入封閉液，37℃下封閉1 h。加入LC3B抗體（1:100）4℃孵育過夜，移除抗體洗滌后加入綠色DyLight 488熒光二抗，37℃孵育1 h，洗滌后加入DAPI染核，加入抗熒光淬滅劑，封片。用熒光顯微鏡觀察，在相同曝光時間下拍照。

1.5 MCF-7細胞LC3B蛋白檢測

細胞分組同1.3。采用Western blotting法，提取MCF-7細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉膜2 h，5%奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗滌后加入一抗（LC3B，1:1000；GAPDH，1:1000）4℃孵育過夜。洗滌后加入相應二抗，37℃孵育1 h。使用ECL進行顯影，用Image J分析軟件定量分析目的條帶的灰度值。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 血清外泌體的分離鑒定

血清外泌體在透射電鏡下呈茶托樣、雙分子層結構。Western blotting法結果顯示，試劑盒提取的血清外泌體具有標志性的CD63及HSP70蛋白。

2.2 MCF-7細胞存活率的比較

Control、Rapa、Exo及Exo+Rapa組的OD值分別為0.367±0.043、0.345±0.031、0.650±0.051、0.420±0.020。結果顯示，雷帕霉素對MCF-7細胞的生長有一定影響，但抑制作用并不明顯，血清外泌體則明顯促進MCF-7細胞的增殖。

2.3 MCF-7細胞LC3B表達的熒光結果比較

如圖1所示，顆粒狀綠色熒光為自噬標志性蛋白LC3B。Control組中，MCF-7細胞有少量的自噬現象；Rapa組中，由于加入自噬誘導劑，細胞的自噬顯著增多；而Exo組的細胞自噬現象與正常對照組相比更少，幾乎無自噬現象；至于Exo+Rapa組的細胞則與Control組相類似。

圖1 MCF-7細胞LC3B表達的熒光結果比較

2.4 MCF-7細胞中LC3B的相對表達量比較

LC3B 2與LC3B 1比值的大小通常用于估計自噬水平的高低，比值越大則自噬水平越高。Control、Rapamycin、Exo、Exo+Rapa組LC3B2/LC3B1的比值分別為1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496。結果顯示，Exo組與Rapa組的差異具有統計學意義（P＜0.05）。Exo+Rapa組與Rapa組的差異有統計學意義（P＜0.05）。外泌體能夠降低MCF-7細胞的自噬且能抑制雷帕霉素誘導的自噬。見表2。

圖2 MCF-7細胞LC3B的相對表達量比較

3 討 論

乳腺癌時至今日仍是發展中國家女性癌癥死亡的主要原因，在發達國家發病率亦居高不下[6]。研究發現，外泌體是一種重要的信號分子，參與細胞通訊，在免疫應答和腫瘤轉移中起重要作用[7]。現階段的研究大多集中于腫瘤分泌的外泌體對癌癥的發展[8]、轉移[9,10]、化學耐藥[11]等多方面的影響。對于血清外泌體的研究則多為生物標志物[12]，其對腫瘤會產生何種影響仍未可知。

我們的研究結果發現，血清外泌體能夠抑制乳腺癌細胞的自噬。而自噬與癌癥緊密相關，并在腫瘤中起雙重作用，能夠抑制腫瘤發生但對腫瘤生長又有著促進作用[13-16]。那么血清外泌體是否能通過抑制腫瘤細胞的自噬，從而抑制腫瘤的生長呢，其抑制自噬的機制又是什么，以及血清外泌體是怎樣從血液進入到腫瘤細胞中的？這些問題值得進一步深入的探討。總而言之，本研究的發現，為抑制腫瘤生長提供了一個新的靶點，為血清外泌體的功能研究開拓了新的方向。

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