慢性乙型肝炎患者自身抗體與HBV基因分型及耐藥突變相關因素研究

陳韌剛，魯 艷，魏三舟，孫 飛，李 敏

(1.湖北省孝感市孝昌縣第一人民醫(yī)院檢驗科 432900;2.湖北省孝感市中心醫(yī)院檢驗科 432100)

乙型肝炎是全世界常見的傳染病之一，如今我國仍是感染乙型肝炎病毒(HBV)最多的國家，據(jù)統(tǒng)計有9 000萬人感染HBV，其中的1/4發(fā)展成慢性乙型肝炎，與HBV感染相關的肝硬化和肝癌嚴重威脅患者的生命安全[1-2]。乙型肝炎患者的病程進展受多階段、多因素綜合影響，有研究表明乙型肝炎的發(fā)展與患者的自身免疫應答、肝細胞損傷和炎性反應有關。感染HBV的患者體內(nèi)出現(xiàn)多種自身抗體，如抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗肝腎微粒體(LKM)等[3]。在肝炎患者治療過程中，一些患者會出現(xiàn)耐藥突變情況，這影響了治療效果[4]。本研究主要選取慢性乙型肝炎患者，探討其自身抗體與基因分型及耐藥突變的相關因素的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月至2017年4月孝昌縣第一人民醫(yī)院慢性乙型肝炎患者216例，其中男164例，女52例，平均年齡44.6歲。納入標準：患者診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2014年版)的標準。

1.2方法

1.2.1標本采集 患者入院次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，離心分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標本檢測 (1)自身抗體檢測：ANA、ASMA和LKM檢測采用間接免疫熒光法，待檢血清起始稀釋濃度為 1∶100，將稀釋血清與生物載片共同孵育 30 min，洗滌后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人免疫球蛋白抗體孵育 30 min，洗片、封片后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。抗可溶性肝抗原/肝-胰抗體(抗SLA/LP)、抗肝細胞溶質(zhì)抗原Ⅰ型抗體(抗LC-1)和抗線粒體抗體Ⅱ型(AMA-M2)采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測，將待測血清1∶100稀釋后加入印跡膜條，室溫搖床30 min，洗膜后加酶標記二抗，室溫搖床30 min，洗膜后顯色10 min，終止觀察結(jié)果。試劑盒購自德國(歐蒙)醫(yī)學實驗診斷有限公司。

(2)HBV基因分型檢測：采用聚合酶鏈反應(PCR)和Taqman熒光探針技術(FAM 標記的B型特異性探針和HEX標記的C型特異性探針)同時檢測標本基因B型和C型。

(3)耐藥突變位點檢測：HBV P區(qū)擴增在PCR擴增引物下完成，將擴增產(chǎn)物純化處理后進行測序和基因分型、耐藥突變位點檢測。測序后突變應用BLAST、DNAstar GeneBank等軟件來確定突變位點。主要對rt204、rt181、rt236等耐藥位點進行分析。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件處理本研究所有數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1自身抗體檢測結(jié)果 216例患者自身抗體檢測結(jié)果，見圖1。216例患者中至少檢測出1種的患者有89例，總陽性率為41.2%。其中以ANA陽性為主，有58例，以低滴度1∶100為主；LKM陽性13例；AMA-M2陽性12例；ASMA陽性7例；抗SLA/LP陽性3例；抗LC陽性4例。

圖1 自身抗體檢測結(jié)果

表1 自身抗體在兩種基因型中分布

2.2HBV基因分型結(jié)果及自身抗體分布 HBV分型結(jié)果顯示，216例患者中B型有30例(13.9%)，男18例，女12例；C型有186例(86.1%)，男128例，女58例。自身抗體在兩種基因型中分布見表1。在自身抗體總陽性對比中，基因型B型和C型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各種類型自身抗體比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3HBV P區(qū)基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的序列突變及耐藥情況 216例患者中共發(fā)現(xiàn)耐藥突變的患者有39例，變異率為18.1%。各耐藥相關位點突變基因型分布見表2。總耐藥位點在兩個基因型中分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各位點在兩個基因型中分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各耐藥相關位點突變基因型分布

3 討 論

HBV感染后患者出現(xiàn)急性肝炎的可能性低，患者極易慢性化，隨著慢性乙型肝炎的發(fā)展，患者逐漸轉(zhuǎn)變成肝硬化，更嚴重的轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟5]。HBV在感染患者的同時，也會通過多種反應來影響機體的免疫系統(tǒng)，損害機體的免疫耐受性，誘導發(fā)生自身免疫反應，加劇肝細胞損壞，使病情遷延不愈，增加治療難度[6-7]。之前，關于慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)自身抗體的報道較多，本研究結(jié)果顯示，216例慢性乙型肝炎患者中自身抗體陽性的患者有89例，占41.2%，其中ANA陽性的最多，有58例，陽性率為26.9%，之后依次是LKM陽性13例；AMA-M2陽性12例；ASMA陽性7例；抗SLA/LP陽性3例；抗LC陽性4例。這說明，自身抗體的出現(xiàn)是造成慢性乙型肝炎患者肝細胞損傷的機制之一。故而慢性乙型肝炎患者檢測自身抗體有助于治療和對疾病的了解，還對探討HBV致病機制具有十分重要的指導意義。

在我國，HBV基因型以B型和C型為主，不同的基因型，因基因的差異可造成致病性的差異，從而影響病情的發(fā)生、發(fā)展，以及自身機體的反應[8-9]。HBV基因型一直是乙型肝炎的研究熱點，自身抗體在不同基因型的HBV患者中分布是否也有差別？本研究基因分型結(jié)果表明，B型HBV有30例患者，C型HBV有186例，自身抗體在兩種基因型中的分布C型高于B型，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這表明自身抗體的出現(xiàn)與基因型可能沒有關聯(lián)，C型更容易產(chǎn)生自身抗體有待于證實。

在過去的報道中，HBV DNA可自然地發(fā)生耐藥位點的突變，在使用抗病毒藥物之后，通過免疫、藥物和自然突變多種因素的影響產(chǎn)生耐藥的HBV，這給治療難度帶來巨大的挑戰(zhàn)。在治療過程中對耐藥位點突變進行檢測，有助于評估藥物療效，從而更好地選擇治療方案和預防處理耐藥問題[10]。本研究選取LAM耐藥相關位點(M204I、M204V、L180M)和ADV耐藥相關位點(N236T、A181T、A181V)，基因位點在B型和C型中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與孫麗娜等[11]研究中M204V、N236T、A181T、A181V 4個位點在B型和C型中的分布存在差異，這可能是由于此次標本量較少所導致的，應增加患者例數(shù)再做分析。

綜上所述，自身抗體與慢性乙型肝炎患者的病程發(fā)展有一定聯(lián)系，不同基因型產(chǎn)生自身抗體和耐藥位點突變在基因型中的分布須進一步進行研究。

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[10]謝巧靈，叢慶偉，吳凌虹，等．耐核苷(酸)類藥物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P區(qū)耐藥突變位點分析[J]．實用肝臟病雜志，2016，19(1)：60-63．

[11]孫麗娜，孫劍，劉學恩，等．乙型肝炎病毒耐藥相關位點變異模式與基因型的相關性[J]．中國病毒病雜志，2012，2(2)：102-106．