大黃素對CCl4誘導小鼠肝纖維化的作用機制△

王云龍，郭海，魏睦新

(1.南京醫科大學 附屬淮安第一醫院，江蘇 淮安 223001；2.南京醫科大學 第一附屬醫院，江蘇 南京 210003)

肝纖維化是各種感染性或非感染性因素引起的肝臟慢性損傷后導致細胞外基質過度沉積的病理過程。肝纖維可進展為肝硬化，甚至是肝癌，給家庭、社會帶來了沉重的經濟負擔，目前尚缺乏有效的治療肝纖維化的藥物[1-3]。隨著對肝纖維化病理生理機制研究的深入，越來越多的研究表明巨噬細胞參與了肝損傷和纖維化的發生、發展，在肝纖維化形成過程中起著關鍵的作用，被稱為肝纖維化的“中心調控者”[4-6]。

肝臟內的巨噬細胞主要是由肝臟本身的庫夫細胞(resident Kupffer cells，KFs)和外周趨化而來的單核細胞組成。現在研究表明在肝臟損傷時肝臟內KFs急劇減少，而外周和骨髓中大量的單核細胞受單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)趨化進入肝臟，分化為單核細胞來源的巨噬細胞[4]。肝臟損傷時趨化進入肝臟的單核細胞，可以通過多種途徑活化肝星狀細胞，如釋放促纖維化的細胞因子轉化生長因子(Transforming growth factor，TGF-β1)[5-6]，導致纖維化的發生、進展。因此減少單核細胞的趨化被認為是治療肝臟纖維化的重要方向之一。

大黃素是大黃、虎杖等常用中藥材中的關鍵活性成分。而大黃和虎杖則是中醫藥治療肝纖維化的常用藥物[7]。近年來對大黃素研究發現其具有良好的抗炎、抗腫瘤和抗纖維化效果[8]。如展玉濤等[9-10]研究發現大黃對肝纖維化大鼠具有良好的保護作用，但大黃素抗纖維化機制仍不清楚。本研究擬在前人研究的基礎上，驗證大黃素對CCl4誘導小鼠肝纖維化的作用，并從單核細胞浸潤的角度探索可能的機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，7～8周齡，體質量(24±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK2016-0001，小鼠分籠飼養，自由飲水進食，實驗前置實驗環境中適應6～8 d，實驗環境溫度控制在(24±2)℃，相對濕度為60%～80%，小鼠處理符合江蘇省人民醫院實驗動物管理的相關規定。

1.2 藥物及試劑

大黃素(上海源葉生物科技有限公司，純度>90%，HPLC，CAS號：518-82-1)。四氯化碳(CCl4，上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20161011)。橄欖油(四川科龍化工有限公司，批號：2015060702)。免疫組化一抗抗體CD45(Abcam公司，ab10558)、CD11B(Abcam公司，ab133357)、F4/80(Abcam公司，ab16911)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Abcam公司，ab5694)。免疫組化二抗-辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司，PV-6001)。Trizol試劑盒(Invitrogen公司，批號：15596-019)、RT-PCR逆轉錄/熒光試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR420A/RR036A)。

1.3 儀器

applied biosystems QuantStudioTM 6 Flex Real-time PCR儀(美國Life Technologies)，applied biosystems 2720 Thermal cycler逆轉錄儀(美國Life Technologies)，Allegra X-15R型臺式高速冷凍離心機(美國Benchtop)，BMJ-1型石蠟包埋機(天津愛華)，Leica RM-2235型石蠟切片機(德國Leica)，Bx60型生物顯微鏡(日本Olympus)，T50型勻漿機(德國IKA)。

2 方法

2.1 分組及肝纖維化模型制備

肝纖維化模型制備參考Karlmark等[4]制作的小鼠肝纖維化模型。將小鼠隨機分為3組：空白組、模型組、CCl4+大黃素即大黃素組，每組8只。適應性飼養7 d后開始造模：大黃素組及模型組按0.6 mL·kg-1的劑量腹腔注射CCl4[CCl4-橄欖油(1∶4)，腹腔注射3 μL·g-1CCl4油劑，每周2次，連續注射4周，建立肝纖維化小鼠模型]。肝纖維化造模成功判斷依據：病理可見小鼠肝臟結構破壞，假小葉形成，大量膠原沉淀。空白組腹腔注射等體積的橄攬油作為對照。大黃素粉末用0.25%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液混懸，配制成適當的濃度，大黃素組小鼠每天給予5 μL·g-1大黃素藥液灌胃，大黃素的劑量為40 mg·kg-1·d-1，此劑量參照展玉濤等[9-10]實驗結果，為治療肝纖維化最適宜的濃度。每天1次，連續4周。空白組和CCl4組給予等體積的0.25% CMC-Na水溶液。

2.2 HE及Masson染色

小鼠麻醉后摘除眼球取血，取小鼠左小葉行中性甲醛固定48 h后，脫水，石蠟包埋，切片厚3 μm，后行HE染色和Masson染色。染色方法參照Huang R等的研究報道[11]。

2.3 免疫組化

采用免疫組化SABC法檢測CD45、CD11B、F4/80、a平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。石蠟切片烘烤后于二甲苯脫蠟，75%乙醇透明，3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化氫酶，EDTA高溫抗原修復，加相應濃度的一抗(CD45 1∶2000、CD11B 1∶50000、F4/80 1∶500、α-SMA 1∶2000)孵育過夜，再加二抗37 ℃ 25 min，最后DAB顯色，中性樹脂封片。

2.4 Real time PCR方法檢測小鼠肺組織的TGF-β1和MCP-1 mRNA相對表達量

取凍存肝組織4 ℃解凍以后，放入DEPC預處理的EP管中，在低溫冰塊上將其剪碎，加入1 mL TRozl進行組織勻漿。提取總RNA：按RNAiso Reagent試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，并測其濃度。逆轉錄反應：按照TaKaRa逆轉錄試劑盒操作規范，反轉錄反應37 ℃、15 min，85℃反轉錄酶失活反應5 s。PCR反應：采用SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒相應反應體系，總體積為20 μL，引物序列如下：MCP-1，上游5′-ATTGGGATCATCTTGCTGGT-3′，下游5′-CCTGCTGTTCACAGTTGCC-3′，引物長度187 bp；TGF-β1，上游5′-GTGGAAATCAACGGGATCAG-3′，下游5′-ACTTCCAACCCAGGTCCTTC-3′，引物長度210 bp；β-actin作為內參，上游5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，引物長度205 bp；分別擴增MCP-1、TGF-β1和β-actin，每個樣本3個復孔，得到閾循環值(Ct)平均值，計算△△Ct值，各個樣本的mRNA表達水平均以2-△△Ct表示。

2.5 免疫組化結果判斷

在光學顯微鏡下觀察組織切片，Masson染色結果及α-SMA免疫組化染色結果在低倍鏡下(×100)進行拍照。用Image-ProPlus軟件測量每個視野中藍色(Masson陽性)或棕黃色(α-SMA免疫組化陽性)區域的面積(像素)，用每個視野Masson陽性或α-SMA免疫組化陽性染色面積(像素)占整個視野面積(像素)的比例為該切片Masson陽性或α-SMA免疫組化陽性的比例。每張切片隨機拍5個視野，取平均值作為該樣本Masson陽性或α-SMA免疫組化陽性的比例。對于CD45、F4/80及CD11b免疫組化結果則選擇在高倍鏡下(×400)。每只動物選取5張切片，每張切片隨機選取5個視野，采用Image-ProPlus軟件計數每個視野下CD45、F4/80及CD11b陽性細胞數，取平均值作為該樣本CD45、F4/80及CD11b陽性的細胞數。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 動物一般情況

空白組小鼠活潑好動，皮毛柔順有光澤，體質量無明顯變化；模型組小鼠活動和攝食明顯減少，精神不振，拱背蜷縮，背毛雜亂無光澤，身體較其他組消瘦；大黃素組大鼠皮毛、飲食與模型組比較有所改善，大便色黃稀軟，小便較黃，體質量較模型組減輕。

3.2 肝組織HE染色

如圖1所示，空白組小鼠肝組織結構完整，肝細胞無壞死，匯管區未見明顯炎性細胞浸潤，結構清晰；而模型組小鼠的整個肝組織結構紊亂，肝小葉結構明顯破壞，形成許多假小葉，匯管區見大量炎性細胞浸潤。而經大黃素治療后的小鼠肝組織整個肝區炎癥較模型組則有明顯改善，肝細胞壞死及假小葉的形成明顯減少，而整個匯管區浸潤的白細胞也較模型組明顯減輕。

3.3 肝組織Masson染色和α-SMA免疫組化

圖2中Masson染色可見空白組小鼠肝臟的肝小葉中央靜脈壁纖維著色，而匯管區及小葉間隔僅有少量纖維著色。模型組小鼠肝組織內的陽性染色較空白組明顯增多，從圖2中可以看出已經形成肝小葉之間的纖維間隔，以及在中央靜脈和匯管區周圍有許多纖維沉積。大黃素組的小鼠肝臟也存在纖維沉積，而這些纖維沉積的分布與模型組小鼠亦相同，但是其膠原沉積的數量、分布密度明顯少于模型組。α-SMA是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化標志蛋白，當HSC被激活并轉化為肌成纖維細胞，即表達α-SMA。在本實驗中α-SMA陽性染色為棕色。空白組小鼠肝臟組織中除了血管平滑肌有少量表達α-SMA以外，其余部位幾乎無表達(見圖2)。模型組小鼠肝組織的α-SMA表達明顯增多，沿匯管區大量分布，呈強陽性染色。而大黃素組雖然也能見到許多陽性染色，但相比較于模型組，α-SMA陽性染色的數量、密度明顯少于模型組。對各組Masson染色和α-SMA免疫組化陽性比例結果做統計分析，結果顯示模型組小鼠Masson染色和α-SMA免疫組化陽性比例明顯高于空白組，而大黃素組Masson染色和α-SMA免疫組化陽性比例雖然高于空白組，但也明顯低于模型組(見圖3)。可見大黃素可明顯改善CCl4所致的小鼠肝纖維化。

圖1 不同組小鼠肝臟HE染色圖

圖2 不同組小鼠肝臟Masson和α-SMA染色圖

注：*P<0.05,**P<0.01；下同。圖3 不同組小鼠肝臟Masson染色(A)和α-SMA免疫組化(B)分析

3.4 CD45、CD11B、F4/80免疫組化

空白組小鼠肝組織中僅有少量的CD45+、CD11B+、F4/80+細胞浸潤，且分布均勻(見圖4)；而模型組小鼠肝組織中見有大量的CD45+、CD11B+、F4/80+細胞浸潤，主要集中在匯管區周圍。對空白組和模型組CD45+、CD11B+、F4/80+陽性細胞進行統計，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；大黃素組小鼠肝臟中亦有CD45+、CD11B+、F4/80+細胞浸潤，但明顯少于模型組。對大黃素組和模型組的CD45+、CD11B+、F4/80+陽性細胞行進行統計，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。見圖5。

3.5 小鼠肝組織TGF-β1和MCP-1的RealTime PCR

如圖6所示，在腹腔反復注射CCl4引起肝纖維化過程中，小鼠肝臟中TGF-β1表達明顯上升(P<0.01)，而給予大黃素灌胃的小鼠肝臟中TGF-β1表達明顯減少(P<0.05)。同時，從圖6中可以看出，與空白組比較，模型組小鼠肝組織中MCP-1的mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，大黃素組肝組織MCP-1的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，相關結果具有統計學意義。

圖4 不同組小鼠肝臟CD45、CD11B和F4/80免疫組化染色

圖5 不同組小鼠肝臟CD45(A)、CD11B(B)和F4/80(C)免疫組化分析

圖6 不同組小鼠肝臟TGF-β1(A)和MCP-1的mRNA(B)表達變化

4 討論

肝纖維化是臨床多種肝臟慢性疾病的并發癥，其發病機制復雜，尚缺乏有效的治療手段。近年來研究發現巨噬細胞在肝纖維化發生的病理機制中發揮著重要的作用[12-13]。巨噬細胞可分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)等細胞因子，通過核轉錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)促進HSC活化[14]；并能合成和分泌大量的促纖維化細胞因子，如TGF-β1和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，TGF-β1和PDGF可直接激活HSC，導致膠原纖維大量合成，引起纖維化[15]。肝臟中巨噬細胞主要有兩個方面的來源，一是肝臟本身的庫夫細胞(resident Kupffer cells，KFs)的自我更新；二是炎癥期間趨化進入的單核細胞。研究發現，去除肝臟本身的庫夫細胞只能部分減輕肝纖維化。而將單核細胞去除后的小鼠，在進行肝纖維化造模過程中，發現肝纖維化較普通小鼠明顯減輕[4]。進一步深入研究發現，炎癥期趨化進入肝臟的單核細胞可以分化為單核細胞來源的巨噬細胞，其可釋放促炎和促纖維化的細胞因子，加重肝損傷和引起肝纖維化。除此之外，近年來還發現一種非典型的單核細胞，細胞膜表面分子標記為Ceacam1+Msr1+Ly6C-F4/80-Mac1+，在肝纖維化過程中被招募至肝臟，具有明顯促纖維化作用，但其促纖維化機制尚不明確[16]。這些研究結果既提示了單核細胞在肝纖維化中的關鍵作用，如何減少單核細胞浸潤可能是治療肝纖維化的一個重要靶點。

大黃素是大黃和虎杖等中藥的主要藥物成分，而大黃和虎杖等中藥是中醫治療肝纖維化的常用藥物。現代研究發現大黃素具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[17-18]，其中大黃素的抗纖維化治療作用已經在肺纖維化和肝纖維化上得到證實[19-20]，但相關機制還沒有完全清楚。近年來有研究發現大黃素有抑制內毒素引起的單核細胞趨化作用[21]。故本研究擬通過檢測肝纖維化過程中單核細胞浸潤的變化來探索大黃素治療肝纖維化的機制。

本研究通過腹腔反復注射CCl4復制小鼠肝臟慢性炎癥造成肝纖維化模型，這也是目前比較認可的肝纖維化模型。結果證實CCl4腹腔反復注射可以引起小鼠肝臟損傷和肝纖維化，發現肝纖維化時肝臟中單核細胞和巨噬細胞浸潤明顯增加，TGF-β1的合成增多，這與既往認識相符[15]。通過分析各組小鼠肝臟的HE染色和Masson染色結果，發現大黃素可以明顯減輕肝臟炎癥和肝臟纖維化。α-SMA是HSC的活化標志蛋白，α-SMA的表達降低說明了大黃素減少肝星狀細胞活化和增殖[22]。CD45、CD11b和F4/80分別是白細胞、單核細胞和巨噬細胞膜表面特異性的標記分子。通過各組小鼠肝臟中CD45、CD11b和F4/80免疫組化檢測，發現大黃素可以減少CCl4腹腔注射引起的白細胞、單核細胞、巨噬細胞在小鼠肝臟中的浸潤。這說明了大黃素可以減少肝纖維化期間單核細胞來源的巨噬細胞的數量。

TGF-β1是目前發現的最強促纖維化細胞因子，可以直接活化肝星狀細胞，分泌細胞外基質，引起肝纖維化[23-24]。研究發現，在肝纖維化形成過程中，TGF-β1主要是單核細胞來源的巨噬細胞所分泌的[25]。這也是單核細胞促進肝纖維化的重要機制。本研究也驗證了在肝纖維化期TGF-β1表達升高，而給予大黃素灌胃后，TGF-β1表達明顯下降。這可能與大黃素減少肝纖維化期單核細胞來源的巨噬細胞浸潤相關。

MCP-1是單核細胞趨化的關鍵細胞因子[26-27]。對MCP-1-/-小鼠進行腹腔反復注射CCl4制備肝纖維化模型時，MCP-1-/-小鼠肝臟中單核細胞浸潤減少和肝纖維化程度減輕[26]。藥理性拮抗MCP-1也有相似作用[27]。這些研究證實了單核細胞在肝纖維化期的趨化主要通過MCP-1實現的。Real time PCR的結果顯示大黃素可以明顯減少肝臟纖維化期MCP-1的表達，推測大黃素是通過減少MCP-1分泌來抑制單核細胞浸潤。

綜上所述，本研究表明大黃素能夠抑制CCl4導致的肝纖維化，其抗纖維化作用的機制可能是通過減少單核細胞來源的巨噬細胞向肝臟浸潤，進而抑制TGF-β1等促纖維化因子的表達，減輕肝臟的炎癥反應和HSC活化發揮其抗纖維化的作用。本研究明確了單核細胞來源的巨噬細胞可能是肝纖維化治療靶點，也進一步揭示了大黃素抗肝纖維化的部分機制，為肝損傷和纖維化的治療提供了新的思路。

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