華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖遷移凋亡的影響△

鄭迪，代國，張政佩，陶春杰，余鈴，郭衛春

(武漢大學 人民醫院 骨科，湖北 武漢 430060)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，全球范圍內平均每年新增乳腺癌患者約170萬例，并且其發病率還在不斷提升[1]。遠處轉移是乳腺癌致死的主要原因，而骨組織則是乳腺癌常見的轉移位點[2-3]。乳腺癌骨轉移造成溶骨性破壞，進而導致高鈣血癥、病理性骨折、疼痛、神經功能損害等一系列骨相關事件[4-5]，對患者的生活造成嚴重影響。研究表明，轉移到骨組織的腫瘤細胞能分泌甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)，通過促進核因子κβ受體活化因子配體(RANKL)分泌并減少骨保護素(OPG)合成，造成RANKL/OPG的比例失調，進而促進破骨細胞分化和成熟，造成骨質破壞，骨基質中儲存的TGF-β大量釋放又反過來促進乳腺癌細胞分泌PTHrP，由此完成乳腺癌骨轉移中的“惡性循環”[6]。因此，通過抑制腫瘤細胞分泌PTHrP有望成為抑制乳腺癌溶骨性骨轉移進程的有效手段。

華蟾素(Cinobufacini)是蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的全皮經提取加工制成的水溶性制劑，具有消腫止痛、活血化瘀和清熱解毒等功效，目前臨床上主要用于肝癌、肺癌、食管癌等腫瘤的綜合治療[7-8]。本研究基于華蟾素的抗腫瘤特性，研究其對MDA-MB-231細胞增殖、遷移及凋亡的影響，探索其抗乳腺癌的相關分子機制，并初步探索華蟾素對MDA-MB-231細胞PTHrP表達的影響，為后續進一步研究提供基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

人TNBC細胞株MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫上海保藏中心；華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司，每支10 mL，批號：160904)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)；新生胎牛血清[Gibco公司(澳洲)]；1%雙抗[青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1，吉諾公司(杭州)]；胰酶(武漢谷歌生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；CCK-8試劑盒(南京碧云天公司)；兔抗人Bax、Bcl-2、PTHrP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、β-actin抗體(美國CST公司)；HRP標記抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 儀器

倒置顯微鏡(Olympus，Japan)；自動酶標儀(Tecan Sunrise，Austria)；流式細胞儀FACSCalibur(Becton-Dickinson，San Jose，CA，USA)。

2 方法

2.1 細胞培養

MDA-MB-231乳腺癌細胞培養在含有10%新生胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1)的DMEM高糖培養基中，于37 ℃、5%二氧化碳細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.2 形態學觀察

將MDA-MB-231細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，24 h后分別加入0、10、20、40、60、80 μg·mL-1華蟾素，置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養48 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態變化并拍照。

2.3 細胞增殖能力檢測

將MDA-MB-231細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設3個復孔，孵育24 h待細胞貼壁后加入不同質量濃度的華蟾素(0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1)，分別培養24、48 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL培養基，繼續孵育1.5 h，用自動酶標儀(Tecan Sunrise，Austria)測量每孔細胞在450 nm波長下的吸光度(A)，所有實驗均進行3次，按公式(1)計算細胞活力。

(1)

2.4 劃痕實驗

取對數生長期的MDA-MB-231細胞，以每孔5×104個接種于12孔板中，待細胞長到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在每個孔底劃出一條直線，PBS洗2次，用倒置顯微鏡拍照后，分別加入無血清DMEM高糖培養基，并調整華蟾素質量濃度為0、20、40、80 μg·mL-1，繼續培養48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄，每組實驗重復3次，按公式(2)計算細胞遷移率。

(2)

2.5 細胞凋亡分析

取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養24 h待細胞貼壁后，加入不同質量濃度的華蟾素(0、20、40、80 μg·mL-1)處理24 h，用0.25%胰酶消化，收集細胞，離心棄上清液后用冷PBS洗滌2次，加入500 μL binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞儀進行細胞凋亡率的檢測。

2.6 Western Blot

用華蟾素(40 μg·mL-1)處理MDA-MB-231細胞24 h后，去除培養基，冷PBS洗滌2次，加入裂解液提取胞質蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后用5%封閉液于4 ℃封閉1.5 h，加入相應一抗孵育過夜，濾膜經TBS緩沖液漂洗3次后，加入相應二抗室溫孵育2 h，增強化學發光顯色系統顯色，使用ImageJ軟件進行灰度分析，β-actin蛋白條帶作為內參照。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 華蟾素對MDA-MB-231細胞形態的影響

用不同質量濃度(0、10、20、40、60、80 μg·mL-1)的華蟾素處理MDA-MB-231細胞48 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化。發現經過48 h處理后，對照組細胞生長貼壁良好，細胞間間隙小，細胞密集、密度大(見圖1A)；而華蟾素處理組中，細胞皺縮變圓，貼壁能力降低，并且隨著華蟾素質量濃度的增加，細胞數量及密度明顯減少(見圖1B～F)。

注：A.對照組；B～F.分別為10、20、40、60、80 μg·mL-1華蟾素處理組。圖1 華蟾素對MDA-MB-231細胞形態的影響(×100)

3.2 華蟾素對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用

為了研究華蟾素對MDA-MB-231細胞增殖的影響，我們用不同質量濃度(0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1)的華蟾素處理MDA-MB-231細胞24 h和48 h。圖2 CCK-8結果顯示，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞增殖，降低其活力，并且隨著華蟾素質量濃度的增加和作用時間的延長，其細胞活力不斷下降，說明華蟾素可以時間、濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的增殖，體現出對MDA-MB-231細胞的毒性作用。

注：與對照組相比，*P <0.05，**P <0.01；下同。圖2 華蟾素體外細胞抑制作用

3.3 華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移的影響

華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響如圖3所示。對照組細胞經過48 h處理后，與0 h相比生長明顯，劃痕愈合明顯(見圖3A～B)，而華蟾素處理組隨著華蟾素濃度(20、40、80 μg·mL-1)的增加，經過48 h處理后，劃痕愈合趨勢不明顯；當用80 μg·mL-1華蟾素處理MDA-MB-231細胞48 h后，細胞生長稀疏，未見劃痕愈合趨勢(見圖3E)。圖4表明，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞的遷移；并且隨著華蟾素濃度的增加，MDA-MB-231細胞遷移率逐漸降低。

3.4 華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

使用不同質量濃度(20、40、80 μg·mL-1)華蟾素處理MDA-MB-231細胞24 h后，采用FITC/PI雙染流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞凋亡率(細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率)。圖5結果表明，細胞凋亡率隨著華蟾素濃度的增加而顯著提高，與空白對照組相比，差別具有統計學意義。

3.5 華蟾素對凋亡相關蛋白及PTHrP表達的影響

為了進一步探究華蟾素抑制MDA-MB-231細胞增殖，誘導其凋亡的分子機制，我們檢測了Bax、Bcl-2、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9等凋亡相關蛋白的表達。Western Blot結果表明(見圖6)，與對照組相比，華蟾素處理組中，Bax、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9表達水平均明顯上調，而Bcl-2的表達則明顯減少。此外，我們還研究了華蟾素對PTHrP表達的影響，結果表明華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達。

注：A～B.分別為對照組0 h和48 h；C～E.分別為20、40和80 μg·mL-1華蟾素處理組48 h圖3 華蟾素對MDA-MB-231細胞劃痕修復實驗結果(×100)

圖4 華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移率結果

4 討論

乳腺癌是惡性腫瘤中導致女性死亡的首要因素[9]，據統計占女性新增癌癥病例的四分之一以上[10]。目前，對于乳腺癌患者的治療，主要包括外科手術、放療和化療。盡管目前治療取得了明顯進步，但仍無法令人滿意。三陰性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中的一種亞型，其雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均為陰性，具有惡性程度高、侵襲能力強、容易轉移和復發等特點，對內分泌治療及抗HER2靶向治療不敏感[11-12]，目前對于此類患者，仍缺乏有效治療手段。晚期乳腺癌患者中有70%左右出現骨轉移[13]，遠遠高于其他器官，而TNBC相對于其他亞型更容易出現骨轉移，因此，尋找新的藥物以改善乳腺癌，特別是TNBC患者的預后，是目前臨床上亟待解決的難題。

注：A.對照組；B～D.分別為20、40和80 μg·mL-1華蟾素處理組；G1～G4.分別為壞死細胞、晚期凋亡細胞、正常細胞、早期凋亡細胞所占百分比；E.各組調亡率比較。圖5 華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響

注：A.蛋白表達條帶；B.表達水平比較。圖6 華蟾素對Bax、Bcl-2、PTHrP、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9表達的影響

研究證明，華蟾素對多種腫瘤如肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌等有抑制作用。孫宇等[14]研究證明，華蟾素能顯著抑制人肝癌細胞HepG-2增殖，誘導其凋亡，可能與華蟾素下調腫瘤細胞TopoⅠ、TopoⅡ表達有關。殷文謹等[15]研究表明，華蟾素能抑制乳腺癌細胞增殖，降低其侵襲能力，并通過下調Cyclin A1、D1等細胞周期中的正向調節因子及促進P21等負向調節因子的表達進而抑制細胞周期進程。本研究基于華蟾素的抗腫瘤作用，研究其對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、凋亡的影響及其機制，并初步探討華蟾素對PTHrP表達的影響，為后續進一步研究提供基礎。

本研究應用不同質量濃度的華蟾素(0、10、20、40、60、80 μg·mL-1)處理MDA-MB-231細胞48 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態及密度變化，結果表明華蟾素處理組中，細胞皺縮變圓，貼壁能力降低，并且隨著華蟾素質量濃度的增加，細胞數量及密度明顯減少，說明華蟾素能抑制MDA-MB-231細胞的增殖。為進一步驗證華蟾素對MDA-MB-231細胞的毒性作用，我們進行了CCK-8實驗，結果表明華蟾素可以時間、濃度依賴性抑制MDA-MB-231細胞的增殖。隨后，我們研究了華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響，劃痕結果表明，對照組中細胞生長明顯，劃痕接近愈合，而華蟾素處理組中隨著華蟾素濃度的增加，劃痕愈合趨勢越來越不明顯，說明華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力有較為明顯的抑制作用。

由于細胞增殖受限與細胞凋亡密切相關，我們隨后檢測了華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響。FITC/PI雙染流式細胞術結果表明MDA-MB-231細胞凋亡率隨著華蟾素質量濃度的增加而顯著提高，說明華蟾素能顯著誘導MDA-MB-231細胞凋亡。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，經典的細胞凋亡途徑主要包括：線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑[16]，均依賴于Csapase級聯反應來誘導。在線粒體凋亡途徑中，當細胞受到凋亡信號刺激后，線粒體外膜通透性增加，線粒體內的凋亡因子，如細胞色素C(Cytochrome，Cytc)等釋放到細胞質，與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1(Apoptotic protease activating facter-1)結合，進而活化Caspase9，進一步激活Caspase3，從而導致Csapase級聯反應的發生以誘導細胞凋亡，而定位于線粒體膜上的Bcl-2家族蛋白如促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2可通過調控Cytc的釋放從而調控細胞凋亡[17]。為了探究華蟾素誘導MDA-MB-231細胞凋亡的分子機制，我們檢測了華蟾素對凋亡相關蛋白表達的影響。結果表明，華蟾素處理組中促凋亡蛋白Bax表達水平上調，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平則顯著下降。Bax與Bcl-2蛋白表達水平失衡，引起線粒體膜通透性改變，從而引起線粒體凋亡通路級聯反應的發生。華蟾素處理組中Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的高表達也驗證了這一通路的激活。表明華蟾素通過線粒體凋亡途徑誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

此外，Western Blot結果表明華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達。正常生理情況下，RANK/RANKL-OPG系統能調節成骨細胞和破骨細胞的活性平衡，使成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收處于平衡狀態，而在乳腺癌骨轉移發生發展過程中，腫瘤細胞通過分泌PTHrP、IL-1等活性因子導致溶骨性骨轉移的發生[18-20]。本研究證實，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達，由此，我們假設華蟾素可通過下調乳腺癌MDA-MB-231細胞中PTHrP進而抑制溶骨性骨轉移的發生，這有待于后續的動物實驗來進行驗證。

綜上所述，華蟾素能抑制MDA-MB-231細胞增殖，降低其遷移能力，并通過線粒體凋亡途徑誘導MDA-MB-231細胞凋亡。總之，我們的研究表明，華蟾素能在一定程度上對三陰性乳腺癌產生抑制作用，至于能否抑制乳腺癌溶骨性骨轉移的發生，有待后續進一步驗證。

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