星點設計-效應面法優化蒼桂顆粒提取工藝△

高夢潔，賈春燕，姜林*

(1.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院 藥學部，新疆 烏魯木齊 830000)

過敏性鼻炎是鼻炎中最常見的類型，我國過敏性鼻炎的患病率近年來也有顯著增加，可能與經濟發展、工業化進程加速、生活方式改變有關。盡管過敏性鼻炎不會危及生命，但會影響生活質量，造成個人及社會的經濟負擔，兒童會因此影響學習成績，嚴重者出現阻塞性睡眠呼吸障礙，甚至影響到頜面部發育[1]。因而對過敏性鼻炎作出正確的診斷，進行有效地預防及治療就顯得尤為重要。蒼桂湯是新疆醫科大學附屬中醫醫院主任中藥師李風森教授臨床應用多年，在呼吸科得到廣泛應用，治療過敏性鼻炎療效顯著的處方。此藥方傳統劑型為湯劑，攜帶不便，易霉變，故擬將其改為顆粒劑，使其便于攜帶，質量穩定。本方由白芷、蒼耳子、桂枝、辛夷等8味藥組成，其中白芷、蒼耳子、辛夷合而為君藥，桂枝、荊芥為臣藥，因白芷中的有效成分歐前胡素難溶于水，故在本方中以打粉加入。選擇君藥蒼耳子和辛夷中的綠原酸、木蘭脂素以及臣藥中桂枝所含的桂皮醛為指標，優化本方提取工藝。且木蘭脂素、綠原酸和桂皮醛相配合，均有治療鼻炎的作用[2-4]。由于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌等為致鼻炎的主要菌種，故通過體外抑菌實驗所得到的抑菌作用評分為藥效學指標，結合化學成分指標，最終確定本方的提取工藝。本實驗以綜合評分(木蘭脂素、綠原酸、桂皮醛、抑菌作用評分)為評價指標，采用響應面法優化提取工藝，為該制劑的工業化大生產提供實驗依據。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(美國Waters 公司，PAD 檢測器，Waters2695)；AG-135電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水儀(Millipore公司，Direct-QTM5)；超聲清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司)；低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)；可控溫電熱套(山東城華魯電熱儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；電熱恒溫培養箱(上海市躍進醫療器械一廠，HH.B11.420)。

木蘭脂素、桂皮醛，綠原酸(批號分別為110882-201607、110710-200714、110753-200413，供定量測定用，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基(產品編號分別為HB4114-19、HB0177-1，青島高科園海博生物技術有限公司)。

藥材飲片均購自新疆維吾爾自治區中醫醫院，經李永和主任中藥師鑒定，均符合2015 年版《中國人民共和國藥典》相關項下的要求。實驗用菌均購自新疆維吾爾自治區藥物研究所。

2 方法與結果

2.1 木蘭脂素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適應性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃-水(35∶1∶64)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：278 nm；進樣量為20 μL。在此條件下樣品中木蘭脂素能達到良好的分離，理論板數按木蘭脂素峰計算不低于3000[5-6]。

2.1.2 供試品溶液制備 取本方10倍量水提液50 mL，置分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖萃取3次，分別為20、20、10 mL，合并萃取液，揮干，用適量甲醇溶解后，轉入5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得[7]。

2.1.3 對照品溶液的制備 取木蘭脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.18 mg的溶液，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺辛夷藥材，其他操作同2.1.2，結果見圖1。

注：A.木蘭脂素對照品；B.樣品；C.陰性樣品。圖1 木蘭脂素HPLC圖

2.1.5 標準曲線的制作 精密稱取木蘭脂素對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得。得標準曲線為Y=116 447.45X+1 127.9，r=0.998 2。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，計算木蘭脂素峰面積的RSD為0.81%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 用同一供試品溶液連續進樣6次，每次進樣量20 μL，根據結果計算重復性RSD為0.57%。

2.1.8 穩定性試驗 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品木蘭脂素峰面積，RSD為1.25%。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入2.5 mg的木蘭脂素對照品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進行含量測定，其平均回收率為103.4%，RSD為2.24%。

2.2 桂皮醛含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適應性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(32∶68)；流速：l.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：290 nm；進樣量為10 μL。理論板數按桂皮醛峰計算應不低于3000[8]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本方10倍量水提液，離心，取上清液5 mL，用甲醇定容于10 mL量瓶中，濾過，取續濾液即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 取桂皮醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.4 mg的溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺桂枝藥材，其他操作同2.2.2，結果見圖2。

2.2.5 標準曲線的制作 精密稱取桂皮醛對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得標準溶液。標準曲線為Y=525 491.8X-179 850.8，r=0.999 7。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.2.1項下色譜條件連續進樣6 次，計算桂皮醛峰面積的RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

注：A.桂皮醛標準品；B.樣品；C.樣品陰性。圖2 桂皮醛HPLC圖

2.2.7 重復性試驗 用同一樣品連續進樣6次，每次進樣量10 μL，根據結果計算重復性RSD為0.33%。

2.2.8 穩定性試驗 取同供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品桂皮醛峰面積，RSD為1.95%。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入3.3 mg的桂皮醛對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行含量測定，其平均回收率為99.24%，RSD為2.78%。

2.3 綠原酸的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適應性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸(10∶90)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；進樣量為10 μL。在此條件下樣品中綠原酸能達到良好的分離，理論板數按綠原酸峰計算不低于3000[8]。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本處方10倍量水提液，離心，取上清液10 mL，水浴蒸干，用甲醇5 mL溶解，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺蒼耳子藥材，其他操作同2.2.2，結果見圖3。

注：A.綠原酸對照品；B.樣品；C.樣品陰性。圖3 綠原酸HPLC圖

2.3.5 標準曲線的制作 精密稱取綠原酸對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得標準溶液。標曲為Y=1 221 440.541X+10 511.648 65，r=0.999 7。

2.3.6精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.3.1項下色譜條件連續進樣6次，計算綠原酸峰面積的RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.3.7重復性試驗 用同一樣品連續進樣6次，每次進樣量10 μL，根據結果計算重復性RSD為1.61%。

2.3.8 穩定性試驗 取同供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品綠原酸峰面積，RSD為1.38%。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入9.6 mg的綠原酸對照品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進行含量測定，其平均回收率為101.08%，RSD為2.75%。

2.4 單因素試驗

2.4.1 浸泡時間的考察 將提取次數固定為2次，提取時間固定為1.5 h，加水倍數固定為10倍，分別考察浸泡時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h對綜合評分的影響，結果各評價指標含量在0.5～1.0 h呈遞增趨勢，1.0～2.5 h無明顯變化，故以1.0 h為最佳浸泡時間。

2.4.2 提取時間的考察 將提取次數固定為2次，加水倍數固定為10倍，浸泡時間固定為1.0 h，分別按0.5、1、1.5、2、2.5 h進行提取，結果在0.5～1.5 h內各評價指標含量呈增長趨勢，1.5 h后呈下降趨勢，故以1.5 h為最佳提取時間。

2.4.3 加水倍數的考察 將提取次數固定為2次，浸泡時間固定為1.0 h，提取時間固定為1.5 h，分別按8、10、12、14、16倍進行提取，結果各評價指標含量在8～10倍呈遞增趨勢，10～16倍呈遞減趨勢，故以10倍為最佳提取倍數。

2.4.4 提取次數的考察 將加水倍數固定為10倍，浸泡時間固定為1.0 h，提取時間固定為1.5 h，分別按1次、2次、3次進行提取，結果各評價指標含量在提取1～3次呈增加趨勢，但2次和3次相差不大，結合實際生產情況選取2次為最佳提取次數。單因素數據見表1。

2.5 體外抑菌實驗

表1 單因素試驗結果

按照單因素篩選出的結果提取藥液，即浸泡時間1 h，提取時間1.5 h，10倍量水提取2次。以培養基將藥液稀釋成為每mL含總藥材4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063 g共7個濃度，經高壓消毒后，將活化的細菌(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌)加入上述培養基中，另設空白對照(有菌無藥)管。因藥物加入培養基后顏色太深，無法觀察其混濁程度，影響結果判斷，故恒溫培養24～48 h后，將各管培養物劃線接種于平板培養基上，再次培養24～48 h，觀察實驗菌生長情況，確定無菌生長的藥物濃度即為最低抑菌濃度(MIC)[9-10]。將恒溫培養24～48 h后的培養物涂布于瓊脂培養基平板上，再次培養24～48 h，觀察平板上菌落形成單位(CFU)。CFU≤5的濃度為殺菌濃度，記“-”號，CFU>5的濃度為無殺菌作用，記“+”號。以產生殺菌作用的最小濃度為最低殺菌濃度(MBC)。結果，本品對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌的最低抑菌濃度分別為2、2、2、2、2 g·mL-1，最低殺菌濃度分別為4、2、2、2、2 g·mL-1，結果見表2。證明本品具有一定的抑菌作用，可進入星點設計，進行提取工藝的優選。

表2 體外抑菌實驗

2.6 提取工藝優選

2.6.1 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選擇浸泡時間、提取時間和加水倍數作為影響因素，固定提取次數為2次。抑菌作用需將提取液均濃縮至藥物濃度2 g·mL-1，然后以涂布后所增長的菌落數進行數據處理(菌落數為0記為100分，菌落數多致無法計算記為1分，100-菌落數/100，即將分值正向化處理后得出每種提取工藝對5個菌抑菌作用的平均值，計算抑菌作用評分)后帶入星點設計，綜合評分(木蘭脂素、桂皮醛、綠原酸含量，抑菌作用評分)為評價指標(根據本方中各化學指標對本方藥效貢獻程度的大小以及本方主要藥效學指標的綜合考慮，決定其權重系數分別為30%、20%、20%、30%)，采用Design-Expert8.0.4軟件Central Composite試驗設計的方案進行研究，篩選最佳提取條件[11-12]。結果見表3～4。

2.6.2 模型的擬合采用 ANOVA對各因素進行多元二次回歸，得到二次擬合方程為Y=82.68-0.73A-4.10B+9.36C-0.51AB-7.50×10-3AC+1.41BC-1.16A2-1.68B2-7.18C2。對其進行方差分析，可知B、C、B2、C2具有顯著性影響，失擬項>0.05，表明失擬項不顯著，相關系數r=0.970 1，表明回歸方程擬合度較好，試驗誤差小，可用該模型對不同條件下的試驗結果進行測定。根據回歸分析結果，利用軟件進行響應面分析，結果見圖4。

表3 響應面試驗設計及結果

表4 方差分析

注：“—”為無法比較。

注：A.浸泡時間和水提倍數對綜合評分的影響；B.水提倍數和提取時間對綜合評分的影響；C.浸泡時間和提取時間對綜合評分的影響。圖4 提取工藝中各因素對綜合評分的影響

2.6.3 驗證試驗 通過對實驗數據的綜合分析，可知最優工藝為浸泡56.96 min，加8.05倍量水提取2次，每次76.71 min。考慮到實際生產需要，將提取工藝定為浸泡60 min，加8倍量水提取2次，每次80 min。再進行3次驗證試驗，結果木蘭脂素平均含量為9.58 mg·g-1；桂皮醛平均含量為11.33 mg·g-1；綠原酸平均含量為11.49 μg·g-1；抑菌作用平均評分為88.11%。綜合評分與預測值的偏差為0.47%，表明該二項式模型擬合效果良好，可信度高。按最終提取工藝提取本方，做體外抑菌實驗，進行涂布和劃線，結果本品對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌的最低抑菌濃度分別為2、2、2、2、2 g·mL-1，最低殺菌濃度分別為4、2、2、2、2 g·mL-1。

3 討論

本文通過單因素考察篩選出各因素的最佳范圍進入星點試驗，再通過星點設計，對提取工藝進行優化。本方為治療鼻炎的經驗方，以君藥和臣藥中主要成分為化學成分指標；所選取的5種菌是導致鼻炎的主要菌種，通過體外抑菌實驗確定了本方對這5種菌具有一定的抑菌作用，故將抑菌作用評分作為本方的藥效學指標。將藥效學指標和化學成分指標相結合，綜合評價提取工藝，進一步優化了本方的提取方法，這是本文的一個創新點，同時也為中藥復方提取工藝的篩選提供了新思路。

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