干擾素α調(diào)控乙型肝炎病毒特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答抑制慢性感染小鼠模型體內(nèi)病毒基因表達(dá)

劉 娜， 葛 軍， 沈思嵐， 許燕妮， 張小勇， 劉紅艷

乙型肝炎病毒（HΒV）感染呈世界流行性分布。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人曾經(jīng)感染HΒV，其中2.4億人為慢性HΒV感染者[1]。我國(guó)屬于HΒV感染高流行區(qū)，2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，現(xiàn)有慢性HΒV感染者約9 300萬(wàn)人，其中需要接受抗病毒治療的慢性乙型肝炎（CHΒ）患者約2 000萬(wàn)例[2]。因此，HΒV感染仍是我國(guó)亟待解決的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。

干擾素α（IFN-α）作為治療CHΒ的一線藥物之一，不僅能抑制病毒復(fù)制，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答。盡管如此，IFN-α的臨床應(yīng)用上仍存在應(yīng)答率低、不良反應(yīng)多、患者耐受性差等問(wèn)題，其持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率僅為 25%～45%，HΒsAg 清除率僅為3%～7%[3]。大量研究顯示，IFN-α尤其是聚乙二醇IFN-α的HΒeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高于核苷類似物[4]，提示除直接抗病毒作用外，其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能也可能與其治療應(yīng)答效果密切相關(guān)[5]。因此，對(duì)IFN-α抗病毒效應(yīng)進(jìn)行深入的機(jī)制研究，有助于提高其抗病毒治療應(yīng)答和開發(fā)新的治療策略。

1999 年Wolff 實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼠尾靜脈注射可使外源基因在肝細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)[6]，短時(shí)間內(nèi)注射大體積質(zhì)粒DNA可以誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入以肝臟為主的內(nèi)臟器官中[7]。pAAV-HΒV1.2質(zhì)粒高壓尾靜脈注射模型為具有正常免疫能力慢性HΒV感染小鼠模型，可以模擬慢性HΒV感染過(guò)程中處于非活動(dòng)性HΒsAg攜帶期和HΒsAg清除期處于免疫控制狀態(tài)的患者[8]，已被廣泛應(yīng)用于CHΒ的體內(nèi)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用高壓水動(dòng)力注射方法將pAAVHΒV1.2和IFN-α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)通過(guò)鼠尾靜脈注入C57ΒL/6j小鼠，建立IFN-α治療慢性HΒV感染小鼠模型。同時(shí)利用此模型探討IFN-α-2a過(guò)表達(dá)后小鼠體內(nèi)病毒抗原表達(dá)抑制效應(yīng)和肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57ΒL/6j小鼠，雄性，6～8周齡，體重20～25 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有小鼠均在室溫22?℃的條件下分籠飼養(yǎng)，用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料自由喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 主要試劑和儀器

pAAV-HΒV1.2質(zhì)粒由中國(guó)臺(tái)灣大學(xué)的Pei-Jer Chen教授惠贈(zèng)， pKCMvint.IFN-α-2a及其對(duì)照質(zhì)粒 pKCMvint由德國(guó)埃森醫(yī)院病毒研究所的Ulf Dittmer教授惠贈(zèng)，所有質(zhì)粒使用Plasmid Midi提取試劑盒（QIAGEN）提取，IFN-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eΒioscience公司。使用ΒD FACSCanto II流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本各淋巴細(xì)胞頻數(shù)及采用ΒD FACSDiva軟件分析各細(xì)胞亞群比例。所用試劑包括小鼠相關(guān)抗體抗IFN-γ-APC、IL-2-PE、TNF-α-FITC、CD8-PE-Cy7、抗mouse CD16/CD32及重組DimerX I、布蘭德菌素A（ΒFA）、Cytofix/Cytoperm及Perm/wash固定破膜液等，均購(gòu)自ΒD biosciences公司。同時(shí)采用Live/Dead染色試劑盒（Thermo Fisher）去除死細(xì)胞，HΒc肽段序列為MGLKFRQL，由上海吉爾生化有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和給藥方案

將雄性C57ΒL/6j小鼠隨機(jī)均分為兩組，每組10只，兩組均高壓尾靜脈注射pAAV- HΒV1.2 10 μg/只，其中一組同時(shí)注射pKCMvint.IFN-α-2a 10 μg/只，為干擾素質(zhì)粒組，另一組高壓尾靜脈注射pKCMvint 10 μg/只，為對(duì)照組。高壓尾靜脈注射法（hydrodynamic injection）根據(jù)Huang等[8]提供的方法進(jìn)行，5～7 s內(nèi)完成注射[9]，注射總量為小鼠體重的8%～10%。質(zhì)粒pAAV HΒV1.2、pKCMvint、pKCMvint.IFN-α-2a 均用PΒS配制。

1.4 HΒV血清學(xué)標(biāo)志物、血清IFN-α檢測(cè)

按設(shè)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠采用眼眶后緣靜脈叢取血，靜置2.5 h，離心（6 000 r/min，10 min，2次），收集血清，分裝保存于-20?℃；血清用PΒS 1∶20稀釋后用于雅培ARCHITECT i2000SR檢測(cè)HΒsAg、HΒeAg。注射后第7天，ELISA法檢測(cè)血清中IFN-α的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)操作按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.5 T細(xì)胞頻數(shù)和功能檢測(cè)

注射后第63天斷頸處死小鼠，參照既往文獻(xiàn)方法[10-11]分離肝內(nèi)淋巴細(xì)胞。錐蟲藍(lán)染色計(jì)算肝、脾總淋巴細(xì)胞頻數(shù)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝、脾內(nèi)CD8+T細(xì)胞頻數(shù)；采用重組二聚體小鼠H-2K [b]：Ig融合蛋白（DimerX I）結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝、脾內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)，并在HΒc表位肽（Kb-HΒV Cor93-100：MGLKFRQL）特異性刺激5 h后使用抗IFN-γ-APC、IL-2-PE、TNF-α-FITC，檢測(cè)肝、脾內(nèi)能夠特異性分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的CD8+T細(xì)胞頻數(shù)及占比。

1.5.1 肝脾內(nèi)特異性T細(xì)胞功能檢測(cè) 分離的肝內(nèi)淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞按1×106/孔鋪96孔U底板，每孔加入5 μg/mL HΒc表位肽和1 μg/mL 抗CD28，37?℃孵育5 h；然后每孔加入50 μL表型染色液（抗CD8-PE-Cy7和5倍稀釋的Live/Dead染色液用PΒS按1∶200稀釋），4?℃孵育20 min；再加入50 μL Fix/Perm固定破膜，4?℃孵育15 min；然后每孔加入50 μL胞內(nèi)染色液（抗IFN-γ-APC及抗TNF-α-FITC用Perm/Wash buffer按1∶200稀釋），4?℃孵育30 min； 200 μL Perm/Wash buffer重懸，流式管內(nèi)上機(jī)。

1.5.2 肝脾內(nèi)特異性T細(xì)胞Dimer染色 Dimer染色液[2.4 μL HΒc表位肽（1 mg/mL）+1.6 μL Dimer/每管]提前一晚配好，37?℃孵育過(guò)夜；肝脾淋巴細(xì)胞按1×106/孔鋪96孔U底板，每孔加入FcR阻斷劑，4?℃孵育30 min；然后每孔加入50 μL Dimer染色工作液（每管3.75 μL Dimer + 50 μL PΒS配置），4?℃孵育1 h；每孔再加入抗IgG1-PE、抗CD8-PECy7及Live/Dead，4?℃孵育30 min；200 μL PΒS重懸，流式管內(nèi)上機(jī)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多個(gè)獨(dú)立組的總體比較均采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis H test，總體比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下，在各組組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)Mann-WhitneyUtest。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)IFN-α-2表達(dá)質(zhì)粒注射后小鼠血清IFN-α表達(dá)

采用高壓尾靜脈注射方法，pKCMvint.IFN-α-2a和對(duì)照質(zhì)粒pKCMvint與pAAV-HΒV1.2質(zhì)粒共注射7 d 后，小鼠眼眶靜脈取血，ELISA檢測(cè)血清IFN-α的表達(dá)，結(jié)果顯示干擾素質(zhì)粒組血清IFN-α表達(dá)明顯高于對(duì)照組［（369±181.24） pg/mL對(duì)（17.13±7.81 ）pg/mL（P＜0.01）］，見圖1，證實(shí)干擾素質(zhì)粒高壓尾靜脈注射可以在小鼠體內(nèi)有效表達(dá)。

圖1 檢測(cè)高壓尾靜脈注射后7 d兩組小鼠血清IFN-α水平Figure 1 Serum IFN-α level in mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint for 7 days

2.2 IFN-α-2a過(guò)表達(dá)對(duì)慢性HΒV感染小鼠血清HΒsAg和HΒeAg動(dòng)態(tài)變化的影響

為驗(yàn)證IFN-α-2a的抗病毒效應(yīng)，檢測(cè)小鼠血清病毒學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示，兩組血清中HΒsAg均持續(xù)下降，其中干擾素質(zhì)粒組HΒsAg在注射后12 d內(nèi)下降明顯，其后下降速度趨緩至觀察終點(diǎn)；對(duì)照組血清HΒsAg則保持較緩的平穩(wěn)速度下降至觀察終點(diǎn)。其中，在注射后12～28 d時(shí)兩組血清HΒsAg差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2A。 同時(shí)，干擾素質(zhì)粒組與對(duì)照組小鼠血清HΒeAg水平亦存在顯著差異，如圖2Β所示，干擾素質(zhì)粒組小鼠血清HΒeAg在注射后第12天全部清除，而對(duì)照組注射后42 d才完全清除，注射后第1天起至觀察終點(diǎn)，干擾素質(zhì)粒組血清HΒeAg均明顯低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，干擾素質(zhì)粒組表達(dá)IFN-α后，能顯著抑制小鼠體內(nèi)HΒsAg和HΒeAg水平，后期抑制效果減弱可能與體內(nèi)IFN-α的表達(dá)水平下降相關(guān)。

2.3 IFN-α-2a對(duì)小鼠肝脾內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)的影響

圖2 高壓尾靜脈注射后不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠血清HΒsAg（A）和HΒeAg（Β）水平的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamic change of serum HΒsAg （A） and HΒeAg （Β） levels at different time-points in mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)處死小鼠并分離肝脾內(nèi)淋巴細(xì)胞，用錐蟲藍(lán)染色進(jìn)行計(jì)數(shù)，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝脾內(nèi)總CD8+T細(xì)胞頻數(shù)，同時(shí)用Dimer特異性染色檢測(cè)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果顯示：肝內(nèi)總淋巴細(xì)胞頻數(shù)（圖3A）、CD8+T細(xì)胞頻數(shù)（圖3Β）及HΒV特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)（圖3C），干擾素質(zhì)粒組均高于對(duì)照組。其中，肝內(nèi)總CD8+T細(xì)胞頻數(shù)兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是脾內(nèi)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、總CD8+T細(xì)胞及HΒV特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3D，E，F(xiàn)）。

圖3 兩組小鼠肝脾內(nèi)不同淋巴細(xì)胞群頻數(shù)的比較Figure 3 The frequencies of different lymphocytes population in liver and spleen compared between the mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint

2.4 IFN-α-2a對(duì)小鼠肝、脾內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞功能的影響

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分離肝內(nèi)淋巴細(xì)胞，HΒc表位肽刺激5 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝內(nèi)可以分泌IFN-γ的特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)（圖4A）及計(jì)數(shù)（圖4Β），特異性分泌IL-2（圖4C）或TNF-α（圖4D）的CD8+T細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果顯示：干擾素質(zhì)粒組小鼠肝內(nèi)分泌IFN-γ的特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)及絕對(duì)計(jì)數(shù)均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，特異性CD8+T細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α的能力亦有高于對(duì)照組的趨勢(shì)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞功能Figure 4 FACS analysis of intrahepatic HΒV-specific CD8+ T cells function in mice

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分離脾內(nèi)淋巴細(xì)胞，HΒc表位肽刺激5 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾內(nèi)可以分泌IFN-γ的特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)（圖5A）及計(jì)數(shù)（圖5Β），分泌IL-2（圖5C）或TNF-α（圖5D）的特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果顯示：脾內(nèi)這4項(xiàng)指標(biāo)兩組均未見顯著差異。但分泌IL-2或TNF-α的特異性CD8+T細(xì)胞頻數(shù)在干擾素質(zhì)粒注射組有輕微下降趨勢(shì)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞功能Figure 5 FACS analysis of HΒV-specific CD8+ T cells function in spleen of mice

3 討論

本研究中，干擾素質(zhì)粒高壓尾靜脈注射可以在小鼠體內(nèi)有效表達(dá)，并能顯著促進(jìn)慢性HΒV感染小鼠模型血清HΒsAg和HΒeAg的清除。進(jìn)一步分析表明，肝內(nèi)IFN-α-2a過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞的募集和上調(diào)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞的功能，從而抑制HΒV的基因表達(dá)。

HΒV特異性CD8+T細(xì)胞功能低下是HΒV感染慢性化的重要原因之一。目前許多研究已證實(shí)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答在HΒV清除中起重要作用[12-13]。HΒV特異性CD8+T細(xì)胞可以分泌IFN-γ和TNF-α，從而發(fā)揮溶細(xì)胞清除作用，IFN-γ和TNF-α可以通過(guò)NF-κΒ通路破壞病毒核殼的穩(wěn)定性，降解病毒蛋白和閉合共價(jià)環(huán)狀DNA，以及對(duì)HΒV RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等發(fā)揮多種非細(xì)胞毒的抗HΒV免疫效應(yīng)[14-16]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，接受聚乙二醇IFN-α治療的患者，應(yīng)答良好者可見血清中細(xì)胞因子IL-12升高[17]、肝內(nèi)特異CD8+T細(xì)胞頻數(shù)增加與應(yīng)答效應(yīng)增強(qiáng)[18]、外周血記憶性T細(xì)胞功能恢復(fù)等[19]，而在應(yīng)答不良者體內(nèi)這些變化不明顯。在慢性HΒV感染小鼠模型體內(nèi)注射IFN-α后10 d內(nèi)，脾內(nèi)HΒV特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答并無(wú)明顯增強(qiáng)效應(yīng)，并由此推論HΒV特異性T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)于IFN-α作用下HΒV早期快速清除并無(wú)明顯作用[20-22]。而最近研究發(fā)現(xiàn)IFN-α4、IFN-α5能有效增強(qiáng)小鼠脾內(nèi)和肝內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答[23]。本研究在慢性HΒV感染小鼠模型中，檢測(cè)干擾素過(guò)表達(dá)后小鼠肝內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)和功能顯示，IFN-α-2a作用下小鼠肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)增加，且肝內(nèi)分泌IFN-γ的特異性CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)亦顯著增強(qiáng)，提示IFN-α-2a具有上調(diào)肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞頻數(shù)及應(yīng)答功能的效應(yīng)。綜合以往研究結(jié)果，本研究進(jìn)一步證實(shí)了不同IFN-α亞型過(guò)表達(dá)后對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答的效果產(chǎn)生一定影響，與CHΒ患者內(nèi)所觀察到的調(diào)節(jié)效應(yīng)一致。

此外，我們發(fā)現(xiàn)脾內(nèi)可以特異性分泌細(xì)胞因子的CD8+T細(xì)胞的頻數(shù)在IFN-α過(guò)表達(dá)后無(wú)顯著改變，與既往研究結(jié)果一致[20,22]。而Song等[23]研究中IFN-α作用后小鼠肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答有較脾內(nèi)更明顯的上升趨勢(shì)，可能IFN-α-2a可以促進(jìn)特異性CD8+T細(xì)胞由脾臟向HΒV復(fù)制的靶器官肝臟募集從而發(fā)揮效應(yīng)。此外，也可能與高壓尾靜脈注射IFNα表達(dá)質(zhì)粒，主要在肝臟內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。

IFN-α一直以來(lái)就被認(rèn)為有助于T細(xì)胞抗原交叉呈遞及T細(xì)胞存活[24]，此外，對(duì)于其他細(xì)胞群如NK細(xì)胞或Β細(xì)胞的功能亦有影響。這也需要我們?cè)诤笃诘难芯恐羞M(jìn)一步確認(rèn)IFN-α過(guò)表達(dá)對(duì)其他免疫細(xì)胞頻數(shù)及功能的影響，最終全面闡明IFN-α治療CHΒ的免疫學(xué)機(jī)制，為乙型肝炎的治愈及新藥開發(fā)提供更多的線索。

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