銅仁市豬瘟病毒抗體的免疫水平監測

張俊波，印雙紅，陸安法，白 明，任品開，吳橙耀，李利霞

（ 1．銅仁學院 農林工程與規劃學院，貴州 銅仁 554300；2．銅仁學院 大健康學院，貴州 銅仁 554300；3．銅仁市動物疫病預防控制中心，貴州 銅仁 554300）

0.引言

豬瘟又稱爛腸瘟，一種由豬瘟病毒引起豬的強烈接觸性、致死性傳染病。由于豬瘟病毒的入侵導致豬的小血管變性，而造成豬的內臟器官出血、壞死和梗塞[1]。該病因具有強烈的致死性和傳染性、發病無季節性，給養豬業造成嚴重的經濟損失，已被列入世界衛生組織（OIE）疫病名錄，并聲明該病為必須申報的傳染病[2]。

豬瘟病毒在世界范圍內廣泛傳播，我國是世界上養豬業較大的國家，所以也是受豬瘟影響較為嚴重的國家，每年因豬瘟致死的豬占總病豬的30%，造成的經濟損失高達100個億[3]。參照相關文獻，關于豬瘟的記載最早出現于1833年美國的俄亥俄州，隨后在胸利亞、日本等國家發現并研究，但是豬瘟的控制都沒有取得很好的成績。直到1933年，丹麥首次宣布了無豬瘟疫情，隨后瑞典、挪威、愛爾蘭等13個國家宣布無豬瘟疫情。近年來，一些宣布已消滅豬瘟的國家又見豬瘟復發的報道[4-5]。豬瘟在我國的相關研究和報道最早于1925年，東南大學研究了CSF免疫血清[6-7]。1956年研制出了一種有效防控豬瘟疫情，對豬無毒但具有豬瘟免疫原形的活疫苗豬瘟兔化弱毒疫苗。使經免疫的豬具有持久免疫能力，也減少了被其他病毒感染的概率。它彌補了滅活疫苗免疫期短，免疫能力低等缺陷。因此，該疫苗被認為是最具有安全性和免疫原性最好的疫苗[8]。至今該疫苗仍被許多國家應用于豬瘟病毒的防控。

1965年，我國提出了徹底消除豬瘟的計劃，經過全國許多專家學者的不懈努力，我國在豬瘟的防控方面取得了非常大的成績。但是目前豬瘟仍然廣泛流行于我國大部分地區，要徹底消滅豬瘟仍然很遙遠[9]。銅仁市是一個少數民族地區，以豬肉為主要肉食，由于地方經濟比較落后，豬場規模不大，一般為一百多頭豬的小規模豬場，而銅仁市各個縣城和市區豬肉市場主要由這些豬場維持，所以這些豬場的豬是否健康直接影響每個縣城和市區人民的健康。關于銅仁市豬瘟免疫方面的研究較少，除了2011年吳高奇等對銅仁市特種野豬規模養殖場豬瘟免疫抗體水平進行監測外，沒有其他的相關資料，而且該文獻顯示，銅仁地區特種豬免疫水平比較低，為了減少豬瘟給銅仁市養豬業帶來的損失，養豬業遵循“預防為主，防重于治”的有效方針，所以全面了解銅仁市豬市場豬瘟免疫水平顯得至關重要。結合銅仁市各地區養豬場規模特點，于2015年5、11月對銅仁市8個縣、兩區的各鄉（鎮）隨機抽取23個養豬場進行春、秋兩次豬瘟血清抗體水平定點檢測工作，為銅仁地區豬瘟的防控提供科學依據。

1．材料與方法

1．1．樣品來源

隨機抽取的銅仁市8各縣兩區（碧江區（3個）、萬山區（1個）、思南縣（3個）、松桃縣（3個）、德江縣（2個）、印江縣（2個）、石阡縣（3個）、沿河縣（2個）、江口縣（1個）、玉屏縣（3個）)共23個100來頭規模大小的豬場定點場，每個豬場隨機采取20份豬血清。

1．2．材料與儀器

1．2．1．試劑與器材

豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒（由武漢科前生物制品有限責任公司提供，批號，20121012，20130110，20130902）。

1．2．2．主要儀器

振動器；自動酶標儀（美國 BioTek儀器有限公司）；單道微量移液槍（eppendorf公司）；8道微量移液槍（thrmo公司）；恒溫培養箱（北京市光明醫療儀器廠）。

1．3．方法

1．3．1．樣品采集

血清共分為2次均等采集，分別是2015年5月、2015年11月。對選定的豬進行前腔靜脈采血，方法分為三個步驟，如下：

（1）豬的保定：對中大豬的保定：用保定繩套住豬的上腭，將繩子斜向上，至豬的頸部皮膚充分崩緊，左右顯出兩個較深的窩。對仔豬的保定：直接仰臥。

（2）進針采血：將豬保定好中大豬后，選取左右兩個窩中較深的一個作為進針點，選定進針點，用碘酊消毒，手持一次性采血盛血器，從對側肩胛骨呈45°方向刺入，抽取5 mL血液。

（3）血清制備：抽取血液完后立即置于 30℃左右環境，傾斜靜置半小時左右，每份吸取血清1 mL于1.5 mL EP管，做好標記，-20℃保存。

1．3．2．間接ELISA原理

在試驗中加入稀釋的對照血清和待測血清，經溫育后，若樣品中含有豬瘟病毒的特異性抗體，則與包被板上的抗原結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分，再加入羊抗豬酶標二抗，與包被板上抗原抗體復合物發生特異性結合，再經洗滌除去未結合的酶結合物，加入底物與抗原抗體復合物發生特異性避光反應10 min，再加入終止液，運用酶標儀測出OD值，即可得到該豬血清的病毒效價。具體操作如下：

檢測前的準備2 h：

（1）解凍，取出冷凍的待測血清置于室溫（20～25℃），充分解凍后，震蕩混勻以備用。

（2）將冷藏保存的試劑盒放置室溫，使其恢復至室溫（20～25℃），備用。

（3）根據實際需要量將洗滌液稀釋20倍盛于燒杯中，備用。

檢測操作：

（4）將待檢血清稀釋20倍。用8道微量移液槍取樣品稀釋液195 μL于稀釋孔中，再逐孔加入待檢血清5 μL，記錄對應的編號，置于震蕩器上混勻。

（5）吸取 100 μL稀釋好的待檢血清于抗原包被孔，貼好封口膜，于37℃恒溫培養箱溫育30 min。

（6）溫育結束后，倒掉抗原包被孔中的液體，在濾紙上拍干。每孔加入200μL稀釋好的洗滌液，在室溫下放置5 min，倒掉洗滌液，拍干。如此重復5次。

（7）洗滌結束后，每個抗原包被孔中加入100 μL羊抗豬酶標二抗，貼上封口膜，置于37℃恒溫培養箱中，溫育30 min。

（8）按步驟（6）的操作方法再次進行洗滌。

（9）洗滌完后，充分拍干包被孔中的液體，先后加入底物A和底物B各50μL，貼上封口膜，避光顯色10min。

（10）顯色后加入終止液5 μL，10 min內用酶標儀測定630 nm波長的吸光度值。

1．3．3．結果轉換

嚴格按照試劑盒使用說明書上的步驟測定其樣品OD值。根據試劑盒說明書，按表1進行OD值與抗體效價的轉換。

表1 豬瘟抗體OD值與豬瘟間接血凝試驗（HIA）效價的轉換Tab.1 Conversion of OD value of swine fever antibody ELISA and the titer of swine fever Indirect Hemagglutination Test(HIA)

2．結果與分析

2．1．銅仁市豬瘟血清采樣數量

本次實驗包括春、秋兩次豬瘟血清監測，共采集豬血清920份，檢測結果中陽性血清有831份。通過對銅仁市八個縣、兩區定點豬場的豬瘟血清ELISA抗體檢測（表2）。

表2 不同地區豬瘟抗體采樣數量Tab.2 Swine fever antibody samples of different regions

2．2．銅仁市豬瘟抗體總陽性率結果分析

該市春季豬瘟血清檢測的460份樣品中，陽性血清40份，占總陽性率為88.91%，平均陽性率為88.33%；秋季檢測的460份血清中陽性血清422份，總陽性率為91.73%，平均血清陽性率89.16%。碧江區、萬山區、思南縣、松桃縣、德江縣、印江縣、石阡縣、沿河縣、江口縣、玉屏縣的春季陽性率依次為：90.00%、80.00%、100%、76.67%、72.50%、100%、100%、82.50%、95.00%、86.67%；秋季陽性率依次為：93.33%、70.00%、95.00%、83.33%、80.00%、95.00%、100.00%、100.00%、75.00%、100.00%（表3）。

表3 不同地區豬瘟陽性抗體統計Tab.3 Swine fever antibodies of different areas

春季抗體效價為1:32以下的血清占總樣本的11.09%（秋季為8.26%），春季抗體效價為1:32的血清占總樣本的25.00%（秋季為23.79%），春季抗體效價為1:64的血清占總樣本的28.70%（秋季為31.52%），抗體效價為1:128的血清占總樣本的23.26%（秋季為23.79%），抗體效價為1:256的血清占總樣本的11.96%（秋季為13.26%）（表4）。從春秋季節豬瘟抗體水平結果可以看出，秋季的豬瘟抗體的免疫水平較高。

表4 不同抗體滴度的樣本數及比例統計表Tab.4 The number and proportion of samples of different antibody titers

2．3．不同地區豬瘟抗體水平結果分析

以抗體效價≥1:32為陽性血清，陽性抗體所占比例較高的為石阡縣，春秋兩季的陽性血清比例均為100%，其陽性率最高。萬山區春秋兩季的陽性率都小于80%，是陽性率最低的地區。血清陽性率達100%，春季包括思南、印江，秋季包括石阡縣、沿河縣和玉屏縣。陽性率達90%以上的，春季包括碧江區（90.00%）、江口縣（95.00%)；秋季包括碧江區（93.33%）、思南縣（95.00%）、印江縣（95.00%），秋季血清陽性率較低有松桃（76.67%）和德江（72.50%）（表5）。

表5 不同地區春秋季抗體水平樣品數統計表Tab.5 The number of samples of antibody level in different regions in Spring and Autumn

春、秋季血清陽性率增大較多的地區，主要表現為抗體效價≥1:32的比例減少，抗體效價為≥1:64、≥1:128、≥1:256的比例增大；血清陽性率增加較少的地區抗體效價≥1:32的比例增大，抗體效價≥1:64以上的比例變化很小；血清陽性率減少的地區中抗體效價為≥1:256比例減小。從各個區縣總體來看，豬瘟抗體秋季陽性率和陽性水平均高于春季（表6和表 7）。

表6 春季不同地區豬瘟抗體抗體水平樣品比例Tab.6 Sample ratio of classical swine fever antibody antibody level in different regions in Spring

表7 秋季不同地區豬瘟抗體水平樣品比例Tab.7 Sample ratio of classical swine fever antibody level in different regions in Autumn

2．4．不同類型豬豬瘟抗體水平結果分析

對不同類型豬瘟抗體陽性率進行分析，結果顯示，公豬血清抗陽性率93.10%，陽性率最高；其次是保育豬，血清陽性率為91.78%，然后依次是：母豬為90.28%，育肥豬為89.30%，哺乳仔豬為89.14%（表8）。哺乳仔豬血清陽性率最低。從整體水平上分析，各類豬血清陽性率存在差異。

表8 不同類型豬豬瘟陽性率Tab.8 Swine fever positive rates of different types of pigs

3．討論

根據《免疫計劃》中存欄豬豬瘟抗體的合格率≥70%為標準，銅仁各地區檢測中萬山區（秋70.00%）陽性率最低，已達到《免疫計劃》的標準，銅仁市豬瘟抗體水平保護力較高。鄒正舉[10]采用豬瘟正向間接血凝實驗赤水市豬瘟血清進行免疫抗體水平監測，結果顯示，赤水市豬瘟抗體合格率為83.19%，諸慶言等[11]在甕安縣豬瘟抗體檢測情況分析與對策中，對36各規模豬場和256戶養殖戶豬瘟血清檢測，抗體效價≥1:32的血清占總樣本的91.22%。簡秀利[12]在貴州規模豬場的三種疫病調查與分析中，對2011年到2013年全省豬瘟抗體進行了調查，結果顯示平均抗體水平為73.60%，其中2011最低，為51.00%。馬曉燕等[13]對新疆地區進行抗體水平監測，新疆地區的豬瘟抗體合格率為71.30%。程漢等[14]對江蘇泰州地區的豬瘟抗體水平檢測顯示，江蘇泰州地區豬瘟病毒陽性率為79.3%。劉建營等[15]對廣東地區年豬瘟抗體水平檢測，結果顯示，廣東地區的豬瘟抗體陽性率占76.50%。以上相關文獻顯示，豬瘟抗體水平在省內外一些地區比較低。

從總陽性率水平分析，銅仁市免疫水平較高，保護力較強。相關文獻顯示，豬瘟抗體效價在≥1:32能抵抗強病毒感染。但對于豬瘟病毒這種強烈致死性和高度傳染性病毒，只要豬瘟病毒存在于豬場，就是非常危險的。只要存在，該病毒就可能在抗體水平較低或沒有達到陽性水平的豬之間傳播，抗體水平較低的豬對豬瘟病毒有抵抗能力，但抵抗能力不強，使之成為帶病豬，表現為免疫耐受。帶病豬也可能通過飲食、大小便直接將病毒傳遞給共同食宿的低于陽性水平的豬，使免疫抗體不合格的豬感染豬瘟。為了減少種種導致豬感染的可能，力求每個養豬場豬瘟抗體陽性率達100%。

造成部分豬場豬瘟免疫效果不佳的原因可能是：在標準的免疫程序生產管理模式下，銅仁市各地區規模豬場還存在管理不規范、免疫劑量不足、疫苗質量不高、防疫意識不強、操作技術不到位等。簡秀利[12]對貴州三種疫病的研究，許追[16]對四個試驗豬場 CSFV、PRRSV和PCV-2混合感染情況的調查表明，豬瘟常常與豬圓環病、豬藍耳病等病癥混合感染，即混合感染等因素，使場內部分豬免疫不合格，個別地區豬場不合格豬占較大的比例。針對現有的這些問題，各地區畜牧局應加大對各地豬場豬瘟及其他疫病的監測，對飼養管理員進行免疫相關知識的培訓普及，聘請專業人員進行免疫操作的指導，加大對混合感染方面的研究，提出對本地區特定的不同日齡豬免疫劑量防控措施，使各地區豬場都有屬于自己科學免疫療程，使銅仁市豬瘟抗體水平提高并保持在更高的水平。

4．結論

綜上所述，目前銅仁市豬瘟抗體水平較高，保護力較強，但是免疫效果還沒有達到預計的水平，該血清學調查為銅仁市豬瘟的防控奠定了基礎。

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