雙向電泳在植物蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用

郭昆

隨著人類基因組計劃與10余種模式生物基因組全序列測定的完成， 基因組計劃的重心已逐漸由結(jié)構(gòu)基因組研究轉(zhuǎn)移到功能基因組研究，生命科學(xué)隨之開始了一個新的紀(jì)元—后基因組時代， 蛋白質(zhì)組研究則應(yīng)運而生。1975年，OFarrell和Klose首先建立了等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE）分離和分析蛋白質(zhì)組分的技術(shù)。該技術(shù)的應(yīng)用，使得多組分，低濃度蛋白的分離成為現(xiàn)實。

1 雙向電泳樣品制備技術(shù)

樣品制備是雙向凝膠電泳成功的關(guān)鍵， 直接影響到蛋白質(zhì)組研究結(jié)果。其一般過程是：對細胞、組織等樣品進行破碎、溶解、失活和還原， 斷開蛋白質(zhì)之間的連接鍵， 提取全部蛋白質(zhì)， 除去非蛋白質(zhì)部分。但溶解度差的蛋白質(zhì)， 如膜蛋白、與膜相連的蛋白質(zhì)以及來自具有高抗性組織的蛋白質(zhì)， 需要添加離析劑、表面活性劑、兩性電解質(zhì)和還原劑等以增加蛋白質(zhì)的溶解度， 提高蛋白質(zhì)的提取率。目前常用的離析劑有尿素和硫脈， 尿素是雙向電泳制備時最常用的變性劑， 硫脈則可以幫助許多難溶的蛋白質(zhì)進行溶解；表面活性劑可消除蛋白質(zhì)疏水基團之間的相互作用，增強蛋白質(zhì)在其pI值處的溶解性，常用的非離子型去垢劑有CHAPS、CHAPSO、SB3-10和ASB-14等。在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，再加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底，常用還原劑為含自由巰基的DTT以及不帶電荷的TBP。

王麗娟分別采用TCA-丙酮沉淀法和尿素一硫脲法提取菜籽種子蛋白，用Bradford法對所獲得的樣品進行蛋白定量后，發(fā)現(xiàn)尿素一硫脲法提取的蛋白質(zhì)所得2-DE圖譜較模糊，低豐度蛋白質(zhì)點數(shù)較少，橫豎紋干擾較大，分辨率較低；而TCA.丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)所得2-DE圖譜蛋白質(zhì)點聚合較好，低豐度蛋白分離較好，蛋白點數(shù)顯著多于尿素一硫脲法，且蛋白點分布均勻，圖譜質(zhì)量較好。張燕等對甘蔗蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)優(yōu)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同裂解液對蛋白質(zhì)干粉的溶解能力存在明顯差異。

2 雙向電泳在植物蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用

2.1 利用雙向電泳建立蛋白質(zhì)組圖譜

利用雙向電泳的高分辨率和高重復(fù)性，建立不同物種植物的蛋白質(zhì)組圖譜，尤其是對已經(jīng)測序植物圖譜建立，可以更好的研究基因的功能，表達后的修飾等方面的研究提供有力的證據(jù)。植物的逆境脅迫可以是非生物脅迫的（abiotic） ， 即由過度或不足的物理或化學(xué)條件引發(fā)； 或者是生物的（biotic） ， 即由其他生物如病原菌所施加。通過對不同逆境脅迫下蛋白質(zhì)組圖譜的建立可以在植物應(yīng)答非生物脅迫包括鹽脅迫、溫度脅迫、干旱脅迫、氧脅迫、金屬離子脅迫和機械傷害等， 和生物脅迫， 如病菌侵害的蛋白質(zhì)組學(xué)研究上提供一些借鑒。對于植物不同發(fā)育階段電泳圖譜的建立可以在不同時間和空間上了解植物發(fā)育過程中蛋白質(zhì)是否表達和表達量的變化，更好的為植物不同階段發(fā)育的研究提供一種有效的方法。

2.2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究

差異蛋白質(zhì)組學(xué)，主要是篩選和鑒定不同種類或狀態(tài)下各樣本之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化，實現(xiàn)對體系內(nèi)代謝調(diào)控的動態(tài)監(jiān)測，揭示細胞生理和病理狀態(tài)的進程與本質(zhì)、對外界環(huán)境刺激的反應(yīng)途徑以及細胞調(diào)控機制，同時獲得對某些關(guān)鍵蛋白的定性和功能分析，從而揭示機體對內(nèi)外界環(huán)境變化產(chǎn)生反應(yīng)的本質(zhì)規(guī)律與基因組的穩(wěn)定性相比，蛋白質(zhì)則具有可變、多樣的特點，即使同一細胞，在不同生理或病理環(huán)境中，其蛋白表達也是不同的。蛋白質(zhì)組的這種特點參與和影響著整個生命過程，這為差異蛋白質(zhì)組的出現(xiàn)與興起奠定了邏輯基礎(chǔ)，差異蛋白質(zhì)學(xué)研究的理論假設(shè)是承認某一細胞或組織在發(fā)生某種正常或異常變化時，其蛋白質(zhì)組會發(fā)生相應(yīng)的、有規(guī)律的改變。如能對此類蛋白進行驗證，進一步證明其與該變化密切相關(guān)，則可認為差異蛋白是這種變化的一類標(biāo)志性蛋白。差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究由于并不要求捕獲“全部”蛋白，而重在找出有意義的差異蛋白，因而有著高得多的可實現(xiàn)性。這種觀點更傾向于把蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法。因此，它對園藝植物的發(fā)育和組織器官分化、突變體、對生物和非生物脅迫的適應(yīng)機制、生理生化過程以及亞細胞結(jié)構(gòu)研究等方面均有著重要的理論與實踐意義。

2.3 對于新蛋白的快速鑒定和分離

轉(zhuǎn)錄水平并不能完全反映基因表達，蛋白質(zhì)是生命活動的承載者，也是大多數(shù)基因功能最終的呈現(xiàn)形式。因此，從轉(zhuǎn)錄水平上所獲取的有關(guān)基因表達的信息并不足以揭示該基因在細胞內(nèi)的具體功能，還需要從蛋白質(zhì)組方面進行深入研究，利用蛋白質(zhì)組技術(shù)尋找與基因相關(guān)的蛋白質(zhì)，進而通過數(shù)據(jù)庫查詢找到相應(yīng)的基因，具有重要的理論和實踐意義。雙向電泳技術(shù)可以快速的鑒定低峰度蛋白，通過雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，可以快速鑒定出電泳圖譜中各個點的蛋白質(zhì)序列。再通過生物信息學(xué)手段，對鑒定蛋白在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，就可以找到未鑒定過的蛋白。依據(jù)這種分離鑒定以及計算機技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可以建立一種高效的、快速的蛋白質(zhì)分離鑒定方法。對于低峰度蛋白表達的檢測和鑒定，具有重要意義。利用該技術(shù)可以進一步研究生物不同條件下代謝途徑，進而建立一種生物系統(tǒng)學(xué)的研究方法。

3 展望

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門新興的學(xué)科，雖然剛剛起步，但卻為大規(guī)模地直接研究基因功能提供了強有力的工具。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在植物研究的多個領(lǐng)域得到初步應(yīng)用。雙向電泳技術(shù)的建立和改進，使得蛋白質(zhì)組學(xué)在基因功能研究、低豐度蛋白的研究和分子系統(tǒng)學(xué)的研究中起了重要作用。綜上所述， 將蛋白質(zhì)組技術(shù)用于生物研究必將會促進未來生命科學(xué)的整體發(fā)展，而雙向電泳技術(shù)則是蛋白質(zhì)組發(fā)展的有力促進劑。