AngⅡ-ROS-PKC/Nrf2/HO-1通路調(diào)控LX-2細胞增殖的機制研究

董文珠 曹曉倩 王璐 陳杭萍 董葉嬌 方佳敏 張敏 惠慧 姚立

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

肝纖維化是由肝組織持續(xù)慢性損傷-修復(fù)引起的細胞外基質(zhì)異常沉積，從而導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)和肝功能異常的一種病理過程，屬于肝硬化的早期階段。已有大量研究表明，去除損傷因素后肝纖維化是可逆的[1]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）作為肝纖維化的主要效應(yīng)細胞，合成和分泌各種細胞外基質(zhì)和膠原，一直被認為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[2]，抑制HSCs的活化增殖或促進HSCs的凋亡是有效減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵[3]。

近年研究表明，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone，RAAS）起著重要的作用，RAAS存在于肝組織中并且可促進肝纖維化的形成[4]。血管緊張素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）通過增加機體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，合成大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），提高機體的氧化應(yīng)激水平[5]。氧化應(yīng)激是諸多肝臟疾病早期共同的致病因素。細胞受到氧化刺激后，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）以Ca2+依賴的形式從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜而被激活[6]，再以直接磷酸化的方式激活核因子相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）。Nrf2-抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response element，ARE）是體內(nèi)一條極為重要的抗氧化應(yīng)激信號通路，該通路在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)防過程中起著非常重要的作用[7]。PKC參與了Nrf2-ARE通路的激活和相關(guān)依賴基因的表達調(diào)控。PKC激活Nrf2后，Nrf2進入細胞核內(nèi)與ARE結(jié)合，啟動下游抗氧化保護性基因，如血紅素氧化酶（hemeoxygenase-1，HO-1）基因的轉(zhuǎn)錄[8]。因此，Nrf2或?qū)⒊蔀楦闻K疾病治療的新靶點，PKC-Nrf2也參與HO-1表達調(diào)控，進而發(fā)揮HO-1的抗氧化和組織保護作用[9-10]。

目前，基于PKC/Nrf2/HO-1通路來研究HSC氧化應(yīng)激損傷的機制尚未見報道。本研究擬采用AngⅡ刺激人源HSC細胞系LX-2細胞，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過檢測ROS和PKC/Nrf2/HO-1通路中各蛋白的表達情況，初步揭示其調(diào)控機制，為探索肝纖維化早期的發(fā)病機制提供借鑒，藉此為從“治未病”的角度防治肝纖維化提供思路。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑 人源HSC細胞系LX-2細胞購于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司（批號：11011-8611），RPMI 1640 Medium Modified細胞培養(yǎng)基購于美國Hy－CloneTM公司（批號：SH30809.01），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于 Vetec 公司（批號：V900090），雙抗購于Gibco公司（批號：15140-122），AngⅡ購于美國 Sigma公司（批號：A9525），2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽 （2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFHDA）購于美國 Sigma公司（批號：D6883），BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（批號：P0012）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒Beyo Ecl Plus（批號：P0018）均購于江蘇碧云天生物技術(shù)公司，HO-1兔單克隆抗體（批號：ab68477）、Nrf2 兔單克隆抗體（批號：ab62352）、PKC兔單克隆抗體（批號：ab179522）均購于abcam公司，β-Actin兔單克隆抗體（批號：#4970）、β-Tubulin兔單克隆抗體（批號：#2178）均購于Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗IgG購于Jackson公司（批號：DW-GAR007）。

1.2 主要儀器和設(shè)備 掃描儀為Clinx Science instruments公司產(chǎn)品，酶標儀購于美國Bio-Rad公司，Guava easyCyte HT流式細胞儀購于默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) LX-2細胞采用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640 Medium Modified培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細胞生長情況，隔天換液，待細胞生長至80%～90%密度時傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 MTT比色法檢測LX-2細胞增殖率 取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%胎牛血清、不含鈣離子和鎂離子的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔104個細胞的數(shù)量接種至無菌96孔板內(nèi)，每孔體積100μL。待細胞貼壁后，分別以10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 AngⅡ（DMSO 溶解）刺激細胞，篩選出最佳濃度，然后以此濃度的AngⅡ刺激LX-2細胞0～48h，每組5個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔分別加入用PBS溶解的MTT（5 mg·mL-1）20μL，繼續(xù)孵育 4h，棄去上清液，每孔加入 150μL的DMSO，置搖床上低速震蕩5min，使紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標儀570nm處測定各孔的OD值，細胞增殖率=（OD刺激孔-OD空白孔）/（OD未刺激孔-OD空白孔）×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測ROS的生成 采用Cai等[11]的方法，以10-5mol·L-1AngⅡ分別刺激LX-2細胞0、0.5、2、12、24、48h 后，0.25%胰酶消化收集各組細胞，PBS 液洗滌 3 遍，調(diào)整細胞濃度為（106～2×107）個/mL，按照1:1 000的比例以無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針 DCFH-DA（原濃度為 10 mmol·L-1），加入各組細胞后37℃避光孵育30min。每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。PBS洗滌3遍后過300目濾膜，流式細胞儀檢測（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm），細胞數(shù)目不少10 000個，以DCF平均熒光強度（the mean fluorescent intensity）值代表細胞內(nèi)ROS的表達水平。

1.3.4 Western blot檢測PKC、Nrf2及 HO-1蛋白表達情況 10-5mol·L-1AngⅡ刺激 LX-2 細胞 0、0.5、2、12、24h，收集培養(yǎng)皿里的細胞，每個培養(yǎng)皿加入100μL裂解液裂解30min，于4℃、12 000r/m離心15min，棄去上清液，提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加5×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸變性5min，制備樣品。向加樣孔內(nèi)加入40μg蛋白樣品和蛋白Marker 5μL，先 80V電泳 50min，后 100V電泳90min，結(jié)束后冰上濕法轉(zhuǎn)膜100V 2h。用含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1h，再以含5%脫脂奶粉的TBST 液稀釋 β-Actin、β-Tubulin、PKC、Nrf2 和 HO-1兔單克隆抗體，將各PVDF膜放入相應(yīng)的一抗中，4℃孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min。加入山羊抗兔二抗IgG，室溫搖床孵育1.5h，回收二抗，TBST洗膜3次，每次10min，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影液滴于PVDF膜，掃膜及圖像分析。以目的蛋白與β-Actin蛋白及β-Tubulin蛋白灰度比值表示蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示。多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析；組間多重比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的AngⅡ作用不同時間對LX-2細胞增殖的影響 不同濃度的AngⅡ刺激LX-2細胞后，細胞增殖率均較正常組升高，但只有AngⅡ濃度為10-5mol·L-1時，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖 1A。據(jù)此，以 10-5mol·L-1的 AngⅡ持續(xù)刺激LX-2細胞48h，觀察各時間點的增殖情況。與正常組比較，接受刺激 0.5、1、2、18、24h 后，LX-2 細胞增殖率明顯升高（P＜0.05，P＜0.001）。見圖 1B。

圖1 AngⅡ?qū)X-2細胞增殖的影響Fig.1 Effect of AngⅡon proliferation of LX-2 cells

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)LX-2細胞對ROS的影響 根據(jù)濃度篩選結(jié)果，選擇10-5mol·L-1為AngⅡ作用濃度。與正常組比較，該濃度AngⅡ刺激LX-2細胞0.5、24h后，ROS顯著增加（P＜0.05）。見圖 2。

2.3 AngⅡ誘導(dǎo) LX-2 細胞對 PKC、Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 根據(jù)濃度篩選結(jié)果，選擇10-5mol·L-1為AngⅡ作用濃度。與正常組比較，該濃度AngⅡ刺激LX-2細胞2、24h后，PKC蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；該濃度 AngⅡ持續(xù)刺激 LX-2 細胞24h后，Nrf2蛋白表達水平呈時間依賴性上調(diào)，其中2、12、24h時 Nrf2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。與正常組比較，10-5mol·L-1AngⅡ持續(xù)刺激LX-2細胞后，HO-1蛋白表達水平先下降后上升，刺激24h時HO-1蛋白表達水平呈顯著性上調(diào)（P＜0.05）。見圖 3。

圖2 AngⅡ?qū)X-2細胞ROS的影響Fig.2 Effect of AngⅡ on ROS of LX-2 cells within 0～48h

3 討論

對于眾多的慢性肝病患者而言，如何使肝硬化或肝纖維化逆轉(zhuǎn)，是目前研究的一個熱點。HSC的持續(xù)激活是肝纖維化的始動環(huán)節(jié)，激活后的HSC會產(chǎn)生眾多細胞因子，其中包括促進肝纖維化的血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、ROS、AngⅡ等，也有抑制肝纖維化的細胞因子如一 氧 化 氮 （nitrogen monoxide，NO）、 脂 聯(lián) 素（adiponectin，APN）等[12]。當損傷肝臟的因素消失后，在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)過程中，HSC也發(fā)生了凋亡，這是肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。AngⅡ作為RAAS中的主要肽類激素，可誘導(dǎo)LX-2細胞的增殖及遷移[14]，ROS、PKC、Nrf2、HO-1 等也參與了此過程[15-16]。

圖3 AngⅡ?qū)X-2細胞PKC、Nrf2、HO-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of PKC,Nrf2,HO-1 protein expression stimulated by AngⅡ(10-5mol·L-1)on LX-2 cells

一般認為，LX-2細胞在體外貼壁生長即為激活狀態(tài)，但活化程度較低，為了更好地模擬肝纖維化發(fā)生時HSC的活化程度，本研究選用AngⅡ作為LX-2的激活劑[17]。采用不同濃度的AngⅡ刺激LX-2細胞，細胞增殖率升高，這與Zhang等[18]研究結(jié)果一致，但是細胞增殖率并不隨AngⅡ濃度增加而增大，本研究中AngⅡ濃度為10-5mol·L-1時對細胞增殖的刺激作用強于10-4mol·L-1，可能是高濃度藥液由于滲透壓增高，導(dǎo)致LX-2細胞增殖反而降低[19]。以10-5mol·L-1AngⅡ刺激LX-2細胞后，在不同時間點檢測細胞增殖情況，AngⅡ刺激0.5、18和24h時，與正常組比較，細胞增殖有統(tǒng)計學(xué)差異，但細胞增殖并不是隨AngⅡ刺激時間延長而增多。采用熒光探針DCFH-DA標記ROS的生成并用流式細胞儀檢測，提示用10-5mol·L-1AngⅡ刺激細胞0.5、24h時，與正常組比較ROS顯著增加，但并不隨AngⅡ刺激時間延長而增多，這與MTT結(jié)果一致。而且受ROS刺激后，PKC蛋白表達趨勢也與細胞增殖趨勢一致，說明細胞的增殖與ROS的生成以及細胞內(nèi)PKC蛋白表達情況密切相關(guān)。

PKC-Nrf2-HO-1通路是體內(nèi)極為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，可維持體內(nèi)的氧化還原平衡，從而降低肝臟對氧化應(yīng)激的敏感性。10-5mol·L-1AngⅡ持續(xù)刺激細胞24h，與正常組比較，AngⅡ刺激0.5、24h時，PKC蛋白表達水平顯著上調(diào)。Nrf2蛋白表達水平呈時間依賴性增高，刺激2h時增高顯著。該結(jié)果提示，AngⅡ先激活PKC，而后誘導(dǎo)Nrf2從復(fù)合物解離并移位入核。而HO-1蛋白表達水平在刺激24h后顯著上調(diào)，這與王寧等[20]研究結(jié)果一致。Nrf2進入核內(nèi)后，識別并結(jié)合ARE，繼而啟動下游抗氧化保護性基因HO-1的表達，減輕細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及氧化應(yīng)激所造成的細胞損傷，對細胞具有保護作用[21]。據(jù)此筆者推測，AngⅡ刺激LX-2細胞，在早期即可產(chǎn)生ROS，促進細胞的增殖，并迅速激活PKC；同時，被ROS活化的PKC可誘導(dǎo)Nrf2從復(fù)合物解離并移位入核，繼而激發(fā)HO-1的表達，啟動了細胞自身潛在的抗氧化作用。這是AngⅡ誘導(dǎo)ROS致肝纖維化的可能機制之一，該機制的揭示為從“治未病”的角度防治肝纖維化提供了新的思路。至于PKC、Nrf2在整個通路中的調(diào)控作用，筆者擬在后續(xù)的研究中采用siRNA技術(shù)沉默PKC、Nrf2的表達以進一步深入考察。

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