大腦中動脈閉塞模型大鼠高分辨力擴散張量纖維束示蹤成像研究

曹宸 張雪君 韓彤

腦卒中發病率、病殘率和病死率均較高，約80%的腦卒中系血管堵塞引起的腦缺血所致［1?2］，因此，建立操作簡便、穩定可靠、重復性佳、接近人類的活體腦缺血動物模型是研究缺血性卒中病理生理學機制和預防與治療措施的重要基本條件。大鼠是模擬人類缺血性卒中的首選對象，雖然大鼠腦組織體積小、白質纖維遠不如人類發達，但相關技術的進步彌補了這一缺點［3］。隨著高分辨力MRI的出現，使得MRI可以從結構和功能上準確、直觀地觀察缺血后腦組織結構變化。高場強（7.0T）MRI圖像質量顯著提高，除增加信噪比（SNR）外，還顯著縮短掃描時間，尤其對于擴散張量成像（DTI）而言，采集方向的增加和分辨力的提高獲得更強的擴散信號，圖像時間分辨力和空間分辨力顯著提高，將不同腦組織之間的對比和細節顯示得更加清晰［4］。本研究對大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠進行高場強、高分辨力DTI和擴散張量纖維束示蹤成像（DTT）掃描，以探討缺血性卒中梗死灶中心和周圍白質纖維束損傷情況。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物 健康清潔級雄性Sprague?Dawley（SD）大鼠30只，周齡8周，體重250～300 g，由首都醫科大學實驗動物部提供，于室溫18～26℃、相對濕度40%～70%、12 h晝-12 h夜循環照明環境中飼養，自由攝食、飲水。

2.試劑與設備 PharmaScan 7.0T MRI掃描儀（美國Bruker公司）由首都醫科大學醫學實驗與測試中心提供，孔徑16 cm，最大梯度場強300 mT/m，配備38 mm大鼠專用表面線圈。Diffusion Toolkit 0.6軟件和TrackVis 0.5.1軟件由美國Athinoula A.Martinos生物醫學影像中心開發（http://www.trackvis.org），DtiStudio 3.0.3軟件由美國F.M.Kirby腦功能影像研究中心開發（https://www.mristudio.org）。質量分數為10%的水合氯醛由天津醫科大學總醫院藥劑科提供。

二、實驗方法

1.動物模型制備與分組 30只大鼠采用隨機數字表法隨機分為對照組和大腦中動脈閉塞模型組（MCAO組）。（1）對照組：10只大鼠，直接行MRI檢查。（2）MCAO組：20只大鼠，采用線拴法制備左側大腦中動脈閉塞模型，并于模型制備后0.50 h行擴散加權成像（DWI）和神經功能評分。DWI顯示梗死側明顯異常信號和神經功能評分1～3分（0分，無神經功能缺損，活動正常；1分，對側前爪不能完全伸展；2分，爬行時出現向對側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能行走，意識障礙；5分，死亡）者為模型制備成功。

2.MRI檢查 兩組大鼠分別于模型制備后3 h、6 h、1 d、2 d、3 d、4 d和 7 d行 MRI檢查。大鼠俯臥位，腹腔注射10%水合氯醛0.30 ml/100 g后以短木簽固定頭部并監測心率和呼吸，行冠狀位掃描，掃描序列包括 T2WI、DWI和 DTI。（1）T2WI：重復時間（TR）3200 ms、回波時間（TE）15 ms，翻轉角（FA）180°，掃描視野（FOV）22 mm ×16 mm，矩陣256×256，激勵次數（NEX）為 1次，層厚 1 mm、層間距0.50 mm，共掃描 15層，掃描時間 102.64 s。（2）DWI序列：重復時間5500 ms、回波時間30 ms，翻轉角90°，掃描視野22 mm×16 mm，矩陣128×128，激勵次數1次，b值為200、400、600、800和1000 s/mm2，層厚1 mm、層間距0.50 mm，共掃描15層，掃描時間22 s。（3）DTI序列：重復時間為 4000 ms、回波時間24 ms，翻轉角 90°，掃描視野 22 mm ×16 mm，矩陣128×96，激勵次數1次，采集126個方向的擴散加權，b值為1000 mm/s2，層厚1 mm、層間距0.50 mm，共掃描15層，掃描時間500 s。

3.圖像處理 采用Diffusion Toolkit 0.6軟件和DtiStudio 3.0.3軟件獲得大鼠頭部部分各向異性（FA）圖、平均擴散率（MD）圖、軸向擴散系數（λ║）圖和徑向擴散系數（λ┴）圖，參照大鼠解剖圖譜，于梗死側皮質、皮質下和胼胝體分別選取大小約為2、2和1 mm2的興趣區（ROI），計算相應FA值、MD值、λ║值和λ┴值。采用TrackVis 0.5.1軟件進行DTT掃描，獲得三維神經纖維圖，于內囊區選取直徑2.50 mm的小球作為興趣區，計算纖維數目（NT）值并觀察其變化。

三、統計分析方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理與分析。正態性檢驗采用Shapiro?Wilk檢驗，兩組大鼠不同時間點梗死側皮質、皮質下和胼胝體FA值、MD值、λ║值、λ┴值和NT值的比較采用重復測量設計的方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

結 果

本研究隨著時間的延長，對照組大鼠死亡5只，最終納入5只；MCAO組大鼠死亡10只，最終納入10只。兩組大鼠不同時間點梗死側皮質、皮質下和胼胝體FA值（均P=0.000）、MD值（均P=0.000）、λ║值（均P=0.000）和λ┴值（均P=0.000）差異均有統計學意義（表1～6），其中，隨著時間的延長，MCAO組梗死側皮質FA值于超急性期（≤6 h）緩慢升高（P=0.000）、急性期（6小時至3天）明顯下降（均P=0.000）、亞急性期（3天至8周）緩慢下降（均P=0.000）并趨于穩定，MD值、λ║值和λ┴值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩定；梗死側皮質下FA值于超急性期緩慢升高（P=0.000）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩定，MD值和λ║值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩定，λ┴值于超急性期即明顯升高（均P=0.000）、急性期和亞急性期緩慢升高（均P=0.000）并趨于穩定；梗死側胼胝體FA值于超急性期緩慢升高（P=0.000）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩定，MD值、λ║值和λ┴值均于超急性期無明顯變化（均P＞0.05）、急性期明顯升高（均P=0.000）、亞急性期有所下降但仍高于超急性期（均P=0.000）并趨于穩定。對照組與MCAO組大鼠梗死側皮質、皮質下和胼胝體FA值（P=0.003，0.000，0.000），皮質下MD值（P=0.013），皮質下和胼胝體λ║值（P=0.012，0.001）和λ┴值（P=0.001，0.036）差異有統計學意義，而皮質MD值、λ║值和λ┴值以及胼胝體MD值差異無統計學意義（均P＞0.05，表1～6）。

兩組大鼠不同時間點梗死側NT值差異有統計學意義（P=0.000；表7，8），其中，隨著時間的延長，MCAO組梗死側NT值于超急性期緩慢下降（P=0.032）、急性期明顯下降（均P=0.000）、亞急性期有所升高但仍低于超急性期（均P=0.000）并趨于穩定。MCAO組大鼠各時間點梗死側NT值低于對照組且差異有統計學意義（P=0.000；表7，8）。

采用DTT分別對兩組大鼠梗死側和健側進行白質纖維束重建（圖1），結果顯示，對照組和MCAO組健側白質纖維束走行自然，形態完整；MCAO組梗死側白質纖維束走行迂曲，部分離斷，邊緣纖維仍保持相對正常，尤其模型制備1 d后，DTT即可見梗死側受損纖維趨于圍繞病灶邊緣（圖2）。

討 論

通過對DTI參數的綜合分析，可以看出缺血后腦組織的微觀變化［5?6］。FA值是定量評價各向異性的最常用參數，代表水分子各向異性成分占整個擴散張量的比例［7］；MD值描述單個水分子的綜合微觀運動，細胞毒性水腫可以導致該值降低［8?9］；λ║值和λ┴值分別代表體素中平行和垂直于纖維方向的擴散系數，可以提供更詳細的擴散方向信息。

表1 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 1. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

表1 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 1. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴散系數；λ┴，radial diffusivity，徑向擴散系數

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表2 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質FA值、MD值、λ║值和λ┴值的重復測量設計的方差分析表Table 2. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in cortex of infarct side at different time points between 2 groups

正常人群白質FA值高于灰質，白質內為平行纖維，較灰質結構更加緊密，故白質λ║值高于λ┴值，表明水分子平行軸突方向擴散較垂直軸突方向更加自由，而灰質λ┴值與λ║值差值較白質小，這是由于灰質水分子布朗運動限制較少，因此，λ║值和λ┴值反映出白質與灰質的結構差異，而MD值無法區分二者［10］。

在本研究中，腦缺血分為超急性期（≤6 h）、急性期（6小時至3天）和亞急性期（3天至8周），超急性期MCAO組大鼠梗死側皮質（灰質）、皮質下（白質）和胼胝體FA值緩慢升高，這是由于腦缺血致細胞毒性水腫，纖維髓鞘腫脹，纖維束間隙減小，但灰質和白質結構小梁尚未破壞。既往的大腦中動脈閉塞大鼠模型研究顯示，腦缺血超急性期FA值呈現明顯不同改變，包括明顯升高、略升高、維持不變或降低［11?12］，多種因素可以導致上述差異，包括缺血原因、病變部位、嚴重程度和圖像質量等。急性期MCAO組大鼠梗死側皮質、皮質下和胼胝體FA值明顯下降，皮質MD值、λ┴值和λ║值升高，皮質下λ║值和λ┴值明顯升高，尤以λ┴值顯著。這是由于梗死灶逐漸形成血管源性水腫，血管內皮細胞損傷，血?腦屏障破壞，血管內大分子物質和水分子外滲至細胞外間隙，隨著這一過程的進行性加重，灰質和白質結構小梁均已破壞，導致FA值明顯下降。亞急性期大鼠梗死側皮質、皮質下和胼胝體FA值仍緩慢下降或有所升高但仍低于超急性期并趨于穩定，皮質下λ┴值有所下降但仍高于超急性期并趨于穩定，表明神經纖維重塑已經發生，這可能是由于增加的軸突和髓鞘導致的，也可能是由于神經膠質細胞增生、瘢痕組織等形成的擴散屏障導致的。

表3 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質下FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 3. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

表3 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質下FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 3. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴散系數；λ┴，radial diffusivity，徑向擴散系數

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表4 兩組大鼠不同時間點梗死側皮質下FA值、MD值、λ┴值和λ║值的重復測量設計的方差分析表Table 4. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in subcortex of infarct side at different time points between 2 groups

DTI技術可以利用水分子擴散的各向異性進行DTT成像，從三維立體角度顯示白質纖維束走行方向及其完整性。本研究DTT掃描顯示，MCAO組大鼠梗死側興趣區纖維束分布較對側明顯稀疏，大部分纖維束卷曲、離斷；尤其模型制備1 d后，梗死側興趣區纖維束NT值即明顯下降，并隨著時間的延長，NT值持續降低，表明腦缺血導致的髓鞘結構破壞、細胞微觀結構喪失仍在繼續；至亞急性期，NT值有所升高，表明此時梗死側神經纖維重塑已經發生，這與DTI參數的綜合分析結果相符。本研究結果還顯示，模型制備1 d后MCAO組大鼠梗死側受損纖維趨于圍繞病灶邊緣，有助于抑制病灶向周圍侵襲，并促進病灶恢復，對梗死灶的神經纖維重塑具有重要作用。

表5 兩組大鼠不同時間點梗死側胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 5. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in the corpus callosum of infarct side at different time points between 2 groups

表5 兩組大鼠不同時間點梗死側胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的比較Table 5. Comparison of FA,MD,λ║ and λ┴ values in the corpus callosum of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動脈閉塞；FA，fractional anisotropy，部分各向異性；MD，mean diffusion coefficient，平均擴散率；λ║，axial diffusivity，軸向擴散系數；λ┴，radial diffusivity，徑向擴散系數

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表6 兩組大鼠不同時間點梗死側胼胝體FA值、MD值、λ║值和λ┴值的重復測量設計的方差分析表Table 6. ANOVA of repeated measurement design of FA,MD,λ║ and λ┴ values in corpous callosum of infarct side at different time points between 2 groups

靜脈溶栓是目前治療急性缺血性卒中的主要方法，但其治療時間窗較窄，多數患者僅能接受藥物治療和相關康復治療，治療方法相對有限［13］。對于缺血性卒中治療方法的研究，動物實驗意義重大。動物實驗顯示，腦缺血后進行數周神經康復治療，有助于神經纖維重塑，促進神經功能恢復；DTI顯示，治療組腦缺血邊緣FA值升高，DTT顯示，梗死灶周圍神經纖維重塑；予神經干細胞治療后，移植的神經干細胞遷移至梗死灶邊緣地區［14?15］。亦有動物實驗提出“神經血管單元”的概念［16］，認為這是一種功能和結構上相互依賴的多細胞復合體，包括神經元、血管內皮細胞、星形膠質細胞和基底細胞，作為一個復雜網絡維持穩定的神經元微環境［17?18］。因此認為，藥物治療不應僅關注神經元功能的維持，還應保護血管完整性及其他神經血管單元成分，并通過DTI和動脈自旋標記（ASL）觀察藥物作用［19］。

表7 兩組大鼠不同時間點梗死側NT值的比較Table 7. Comparison of NT value of infarct side at different time points between 2 groups

表7 兩組大鼠不同時間點梗死側NT值的比較Table 7. Comparison of NT value of infarct side at different time points between 2 groups

MCAO，middle cerebral artery occlusion，大腦中動脈閉塞

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表8 兩組大鼠不同時間點梗死側NT值的重復測量設計的方差分析表Table 8. ANOVA of repeated measurement design of NT value of infarct side at different time points in 2 groups

圖1 頭部DTT掃描所見 1a 對照組大鼠白質纖維束走行自然，形態完整 1b MCAO組大鼠健側白質纖維束走行自然，形態完整；梗死側白質纖維束走行迂曲，部分離斷 圖2 頭部DTT掃描顯示，MCAO組大鼠模型制備1 d后梗死側受損纖維趨于圍繞病灶邊緣Figure 1 Brain DTT findings The white matter fiber tracts in control group were normal and intact(Panel 1a).In MCAO group,the white matter fiber tracts in the affected side were twisted and disconnected,but the contralateral white matter fiber tracts were normal and intact(Panel 1b).Figure 2 Brain DTT showed the damaged fibers tended to be around the edge of lesion 1 d after MCAO model establishment.

神經纖維重塑的解剖學基礎目前尚不清楚，推測有多種因素發揮重要作用。第一，為促進神經功能恢復，重塑區可能發生軸突出芽，形成新的神經元之間連接。第二，神經膠質細胞增生可能發揮重要作用，神經膠質細胞增生提高軸突的定向性。神經元與神經膠質細胞之間的溝通對軸突傳導、突觸傳遞和信號轉導具有重要作用，神經膠質細胞調控神經元周圍環境，包括離子流量、神經遞質、細胞間黏附分子（ICAM）、傳遞因子和神經生長因子（NGF）等，通過釋放神經遞質及其他信號轉導分子，神經膠質細胞可以影響神經興奮性和突觸傳遞，并協調神經網絡活性。第三，受損的白質纖維束圍繞病灶形成天然屏障，可以保護周圍尚未受損的腦組織，并使新生軸突進入損傷區，促進其在梗死灶邊緣重新建立新的連接［20］。

本研究采用高場強（7.0T）DTI和DTT技術對大腦中動脈閉塞模型大鼠白質纖維束進行精細成像，克服小視野DTI成像分辨力不足的缺點，但尚待補充更大樣本量、更長時間點的影像學數據，并進行病理學檢查。

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