丙酮酸乙酯對(duì)利福平致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

李曉理

利福平(rifampicin, RFP)是世界衛(wèi)生組織推薦的一線抗結(jié)核藥物之一。利福平單獨(dú)或者與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用時(shí)，都可引起不同程度的肝損傷，但具體的發(fā)病機(jī)制仍未明確。高遷移率族蛋白BI (high mobility group box-1, HMGB1) 是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)大的致炎細(xì)胞因子，可能與異煙肼、利福平合用所致的大鼠肝損傷有關(guān)[1]。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)作為一種有效的HMGB1釋放抑制劑，可降低膿毒癥、蛛網(wǎng)膜下腔出血、肝癌等動(dòng)物模型的死亡率[2-4]。目前，尚未見EP防治利福平致肝損傷的作用及其機(jī)制的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制利福平致肝損傷小鼠模型，探討EP對(duì)利福平致肝損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001]。

1.1.2 藥品及試劑 利福平，5 g/瓶，批號(hào)R3501，美國Sigma公司生產(chǎn)；丙酮酸乙酯，25 g/瓶，批號(hào)E47808，美國Sigma公司生產(chǎn)；HMGB1多克隆抗體，1 mg/mL，批號(hào)A515，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；小鼠血清生化檢測(cè)試劑，購自瑞士Roche公司；小鼠蛋白測(cè)定試劑盒、總膽汁酸(total bile acids, TBA)測(cè)定試劑盒、乙酰化高遷移率族蛋白B1(acetylated-high mobility group box-1, AC-HMGB1)測(cè)定試劑盒均由上海聯(lián)碩生物科技有限公司生產(chǎn)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀，瑞士Roche Modular DPP產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；成像系統(tǒng)，美國阿爾法公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組、模型建立及給藥

1.2.1 藥物配備 RFP灌胃液配制：將RFP溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中配置成濃度為10 g/L的混懸液；EP液配制：將EP溶解到格林液中，配置成3.26 g/L的溶液，消毒，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型建立和動(dòng)物分組 參考文獻(xiàn)[5-6]。將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和EP組，每組8只。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫22～25℃，相對(duì)濕度(50±5)%，明暗各12 h。正常對(duì)照組、模型組和EP組分別給予等量溶劑(0.5%羧甲基纖維素鈉)、利福平200 mg·kg-1·d-1、利福平200 mg·kg-1·d-1，每天1次定時(shí)空腹灌胃。EP組給予腹腔注射丙酮酸乙酯40 mg·kg-1·d-1，其余兩組每天1次腹腔注射等量溶劑(格林液)。連續(xù)給藥7 d后，處死全部小鼠。

1.2.3 標(biāo)本采集 小鼠處死前，隔夜禁食、禁水12 h。處死前稱量小鼠體質(zhì)量，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉后摘除眼球取血、摘取小鼠肝臟。留取血清標(biāo)本，-80℃凍存待測(cè)；稱肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝濕重/小鼠體質(zhì)量×100%)；各組切取相同部位肝組織，10%福爾馬林緩沖液固定，用于觀察肝臟病理變化；余組織保存于液氮罐中，待測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 一般情況觀察 每3天稱小鼠體質(zhì)量1次，觀察并記錄其體質(zhì)量變化、飲食情況、毛色、皮膚黏膜顏色、大小便、精神狀態(tài)及對(duì)外界刺激的反應(yīng)情況等。

1.3.2 血清生化指標(biāo)測(cè)定 用生化分析儀測(cè)定各組小鼠血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的水平。

1.3.3 肝組織病理學(xué)檢查 常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下，觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化[2]。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)肝組織中HMGB1蛋白的表達(dá) 免疫組化染色法采用PV二步法，參考試劑盒說明書操作。HMGB1多克隆抗體工作濃度1∶50。染色完成后，鏡下攝片。每張切片在高倍顯微鏡下(400倍)隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野，用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定平均光密度值(OD)。

1.3.5 肝組織勻漿 取肝組織100 mg，勻漿取上清液；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肝組織蛋白濃度，ELISA法測(cè)肝組織TBA、AC-HMGB1的含量，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，羥胺法測(cè)定SOD活性，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)、食欲較好，毛色光澤尚可，無黃染，對(duì)外界刺激反應(yīng)較靈敏。模型組小鼠精神狀態(tài)差，腳掌可見輕度橘黃染，大小便呈橘紅色，進(jìn)食和活動(dòng)情況較前減退，體質(zhì)量較前輕度下降，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。EP組小鼠精神狀態(tài)稍差，腳掌皮膚黃染程度、大小便顏色較模型組均減輕，體質(zhì)量較前稍增長，對(duì)外界刺激反應(yīng)尚可。造模后第7天模型組小鼠肝濕重及肝指數(shù)較正常對(duì)照組升高(P<0.05)，EP組小鼠肝濕重及肝指數(shù)較模型組降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 造模后第7天3組小鼠體質(zhì)量、肝濕重、肝指數(shù)比較

2.2 血清肝生化指標(biāo)變化 與正常對(duì)照組比較，模型組的血清TBIL、DBIL、ALP、ALT升高(P<0.05)；與模型組相比，EP組的TBIL、DBIL、ALP、ALT降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)變化

2.3 肝臟大體形態(tài)及組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組小鼠肝臟顏色紅潤，被膜光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，鏡下肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞未見異常。模型組小鼠肝臟部分偏黃，邊緣稍鈍，質(zhì)地基本柔軟，鏡下可見肝細(xì)胞排列紊亂，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞可見明顯的空泡變性、脂肪變性，部分肝細(xì)胞可見嗜酸性變、核溶解或固縮。EP組小鼠肝臟外觀基本正常，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞空泡變性、脂肪變性較模型組明顯減輕。詳見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理學(xué)改變(HE×400)

2.4 肝組織HMGB1的表達(dá)情況 光鏡下可見，正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞HMGB1微量表達(dá)，胞漿內(nèi)和細(xì)胞核均可見淡黃、棕黃色著色(見圖2)，其中陽性表達(dá)多位于肝細(xì)胞核中，OD值為 (0.18±0.027)。模型組小鼠肝細(xì)胞HMGB1的表達(dá)增強(qiáng)，胞漿內(nèi)和細(xì)胞核中著色增強(qiáng)，且胞漿中陽性表達(dá)增強(qiáng) (見圖2)，OD值為(0.30±0.039)，高于正常對(duì)照組(P<0.001)。EP組小鼠肝細(xì)胞HMGB1表達(dá)較模型組減少，陽性表達(dá)多位于肝細(xì)胞核中(見圖2)，OD值為(0.24±0.016)，低于模型組(P<0.001)。 三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.37，P<0.001)。

圖2 各組小鼠肝HMGB1的表達(dá)(IHC×400)

2.5 肝組織中AC-HMGB1、TBA、SOD、MDA的水平 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中AC-HMGB1、TBA、MDA升高(P<0.05)，SOD下降(P<0.05)；與模型組比較，EP組小鼠肝組織中的AC-HMGB1、TBA、MDA降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠肝組織中AC-HMGB1、TBA、MDA、SOD水平變化

3 討論

利福平廣泛用于抗結(jié)核治療，單獨(dú)或者與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用時(shí)均可引起不同程度的肝損傷，是抗結(jié)核藥物最常見的毒副作用之一，也是結(jié)核患者停止治療的最常見的原因之一。因此，研究利福平致肝損傷的發(fā)病機(jī)制及其防治手段具有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠給予利福平灌胃7 d后肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空泡變性、脂肪變性，部分肝細(xì)胞有嗜酸性變，核溶解或固縮，同時(shí)伴有血清TBIL、DBIL、ALP、ALT及肝組織TBA水平明顯升高。表明已成功復(fù)制出利福平致肝損傷小鼠模型，但脂肪變性及炎癥反應(yīng)不及文獻(xiàn)[5]報(bào)道明顯，考慮可能與小鼠品系不同有關(guān)。

HMGB1是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白，對(duì)維持核小體穩(wěn)定、DNA 重組、復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄有重要作用[7]。當(dāng)外界有適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激細(xì)胞時(shí)，HMGB1賴氨酸殘基被乙酰化，然后釋放到細(xì)胞外，參與炎癥反應(yīng)[8]。AC-HMGB1參與了梗阻性膽汁淤積性肝損傷的發(fā)病及發(fā)展過程[9]，降低HMGB1的乙酰化水平可以明顯改善膿毒癥相關(guān)性腦病的認(rèn)知功能障礙、減輕肝組織缺血再灌注損傷的程度[10-11]等。AC-HMGB1可作為藥物性肝損傷(drug-induced liver injury, DILI)的免疫損傷指標(biāo)，對(duì)判斷DILI的嚴(yán)重程度及預(yù)后有重要價(jià)值[12]。前期實(shí)驗(yàn)[2]表明，HMGB1表達(dá)增加與分布異常與異煙肼聯(lián)用利福平致大鼠肝損傷的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞HMGB1微量表達(dá)，且陽性表達(dá)多位于細(xì)胞核中，與文獻(xiàn)[2]報(bào)道有差異，可能與不同實(shí)驗(yàn)中所用鼠的種屬不同有關(guān)，但不能排除不同實(shí)驗(yàn)中所用不同溶劑的影響，可能需進(jìn)一步驗(yàn)證。模型組肝細(xì)胞HMGB1的表達(dá)增多，胞漿明顯，且AC-HMGB1的表達(dá)明顯增多，同時(shí)HMGB1的表達(dá)強(qiáng)度和分布與肝臟的病理嚴(yán)重程度相一致，提示HMGB1表達(dá)增加和分布異常、AC-HMGB增加與利福平致肝損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

MDA、SOD分別是反應(yīng)機(jī)體內(nèi)氧化、抗氧化程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，利福平可以導(dǎo)致小鼠肝組織中MDA水平升高，SOD活性降低，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道相符；予以EP干預(yù)后，MDA水平下降，SOD活性升高。提示EP可以通過抗氧化作用減輕利福平致小鼠肝損傷。

EP作為一種有效的HMGB1釋放抑制劑，不僅可以抑制HMGB1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，而且可以降低HMGB1的乙酰化程度，減少HMGB1釋放到細(xì)胞外，減輕促炎細(xì)胞因子反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，達(dá)到對(duì)臟器的保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，EP可顯著減輕小鼠肝組織的病理損傷，同時(shí)降低肝組織HMGB1和AC-HMGB1的表達(dá)。說明EP可以通過降低小鼠肝組織中HMGB1及AC-HMGB1的水平來減輕利福平致小鼠肝損傷的程度。

HMGB1是損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)中的一員，由215個(gè)氨基酸組成，其23、45、106位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基使HMGB1成為一種氧化還原敏感分子；它的易位、釋放和活動(dòng)均受到氧化還原反應(yīng)的嚴(yán)格控制[15]。隨著活性氧自由基的積累，巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞可產(chǎn)生大量的HMGB1并促使其乙酰化釋放到細(xì)胞外，同時(shí)HMGB1又可以通過釋放炎癥因子來促進(jìn)機(jī)體的氧化應(yīng)激。丙酮酸乙酯是一種有效的抗氧化劑，其抗氧化機(jī)制可能與其a-酮羧基及親脂特性有關(guān)，a-酮基可直接與過氧化物產(chǎn)生還原反應(yīng)，清除過氧化物及其氧自由基等有害物質(zhì)[16]。嚴(yán)重燙傷內(nèi)毒素血癥大鼠TNF-a和HMGB1水平與丙二醛水平呈正相關(guān)，與SOD活性呈負(fù)相關(guān)，予以丙酮酸乙酯抗氧化應(yīng)激后，可以減輕炎癥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸乙酯降低HMGB1及其乙酰化水平、減輕利福平致小鼠肝損傷的程度的作用，可能與其抗氧化作用有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，HMGB1表達(dá)、分布異常及AC-HMGB1與利福平致小鼠肝損傷的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)；丙酮酸乙酯可通過抗氧化，降低HMGB1及其乙酰化水平、調(diào)節(jié)HMGB1分布來減輕利福平致藥物性肝損傷。HMGB1有望成為防治利福平致肝損傷的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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