槲皮素對(duì)宮頸癌細(xì)胞C33A增殖和凋亡的影響

槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒以及清除自由基等多種作用[1]。研究[2-5]表明，槲皮素可有效抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，槲皮素還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可與其他化療藥物聯(lián)合用于腫瘤的化學(xué)治療[6-10]。

因此，本研究通過(guò)槲皮素作用于人宮頸癌C33A細(xì)胞,研究槲皮素對(duì)C33A細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并初步探討其相關(guān)作用機(jī)制，為臨床槲皮素治療宮頸癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人子宮頸癌細(xì)胞系C33A購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0045)。 槲皮素購(gòu)于Sigma公司(Q4951)，順鉑購(gòu)于Sigma公司(479306-1G)， DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司(12100-046)，胎牛血清購(gòu)于HyClone公司(SH30070.04)，Cyclin D1鼠單克隆抗體(sc-20044)、Caspase-3鼠單克隆抗體(sc-273503)、Caspase-9鼠單克隆抗體(sc-273525)和β-actin鼠單克隆抗體(sc-130656)均購(gòu)于Santa Cruz公司，二甲基亞砜 (dimethylsulfoxide， DMSO)購(gòu)于Sigma公司(D-2678)，噻唑藍(lán)染液(thiazole blue，MTT)購(gòu)于Sigma公司(BR-03955)，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌C33A細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng), 每3～4 d用胰酶消化、傳代1次。

1.2.2 藥物配置與實(shí)驗(yàn)分組 將241.792 mg槲皮素溶于10 mL DMSO中作為備用母液，-20℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)，將1 mL母液加入999 mL DMEM培養(yǎng)液稀釋為80 μmol/L，之后分別等倍稀釋為20、40 μmol/L，DMSO的最終濃度<0.1%。將C33A細(xì)胞分為對(duì)照組(1640培養(yǎng)基+DMSO)、槲皮素組(20、40和80 μmol/L)、順鉑組(5、10、15、20 μg/mL)、聯(lián)合組(槲皮素40 μmol/L+順鉑 10 μg/mL[11])。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 C33A細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，按照4×104個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔加入200 μL 1640培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后,換為含有不同濃度的槲皮素和順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)。各孔細(xì)胞在培養(yǎng)24 h和48 h后，吸棄培養(yǎng)液，分別加入100 μL MTT(5 g/L)，37℃孵育4 h后吸棄上清液；再分別加入150 μL DMSO，混勻后測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處每孔的光密度值(optical density，OD) ，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=(槲皮素組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 C33A細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后, 更換為含有不同濃度(空白對(duì)照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培養(yǎng)液中。48 h后收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，吸棄上清，加入70%酒精4 ℃固定12 h。再次離心，用含0.01% RNase的碘化丙啶(propidium iodide，PI)避光染色30 min后，上機(jī)檢測(cè)。通過(guò)CellQuest軟件分析結(jié)果，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) C33A細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后, 更換為含有不同濃度(空白對(duì)照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培養(yǎng)液中。48 h后收集細(xì)胞，裂解并測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度，行SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，將膜移至含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×4次。加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，用檢測(cè)液行發(fā)光反應(yīng)，于暗室中曝光，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)C33A細(xì)胞活力的影響 經(jīng)過(guò)槲皮素處理24 h后，各組細(xì)胞活力分別為(86.92±3.953)%(20μmol/L組)、(66.54±3.932)%(40μmol/L組)和 (52.21±2.970)%(80μmol/L組)，均低于空白對(duì)照組的(98.35±1.230)% ；經(jīng)過(guò)槲皮素處理48 h后，各組細(xì)胞活力分別為(65.19±7.071)%(20μmol/L組)、(47.04±8.881)%(40μmol/L組)和 (29.71±6.505)%(80μmol/L組)，均低于空白對(duì)照組的(96.97±1.788)%。C33A細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的槲皮素處理后，細(xì)胞活力均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)不同濃度的順鉑(5、10、15、20 μg/mL)處理后C33A細(xì)胞的細(xì)胞活力也低于空白對(duì)照組(P<0.05)；此外，槲皮素40 μmol/L+順鉑 10 μg/mL聯(lián)合作用于C33A細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力下降為(31.12±2.835)%； 48 h后，細(xì)胞活力下降為(17.86±3.182)%，低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 槲皮素及順鉑對(duì)C33A細(xì)胞活力的影響

2.2 槲皮素對(duì)C33A細(xì)胞周期的影響 C33A細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度(空白對(duì)照、20、40和80 μmol/L)槲皮素作用48 h后，G0/G1期細(xì)胞百分比為(47.07±2.404)%、(52.48±1.188)%、(60.30±1.874)%和(64.54±2.157)%，S期細(xì)胞百分比為(29.41±2.114)%、(23.69±1.881)%、(20.41±3.111)%和(16.62±1.570)%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.3 槲皮素對(duì)C33A細(xì)胞Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)前期MTT的結(jié)果，在槲皮素濃度為40 μmol/L，作用時(shí)間為48 h的條件下，對(duì)C33A的細(xì)胞活力的抑制作用比較明顯，而且細(xì)胞凋亡的作用也不至于過(guò)于強(qiáng)烈，因此選擇該條件來(lái)檢測(cè)槲皮素對(duì)蛋白表達(dá)的影響。與空白對(duì)照組(蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：0.315±0.024、0.082±0.019、0.070±0.006)相比，槲皮素(濃度為40 μmol/L)作用于C33A 細(xì)胞48 h后，Cyclin D1表達(dá)降低(0.152±0.002)，Caspase-3 和Caspase-9的表達(dá)增多(0.481±0.013、0.306±0.014)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.687、17.020、15.690，P=0.022、0.003、0.004)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 槲皮素對(duì)Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

表2 槲皮素對(duì)C33A細(xì)胞周期的影響

3 討論

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，包括蕓香苷和槲皮苷2種糖基化形式，廣泛分布于水果、蔬菜及多種中草藥中。研究[1-3]表明，槲皮素有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎以及保護(hù)心血管等功能。本研究中，宮頸癌細(xì)胞C33A經(jīng)不同濃度槲皮素作用24 h和48 h后，C33A細(xì)胞活力同空白對(duì)照組相比出現(xiàn)了明顯的下降。上述結(jié)果表明，隨著槲皮素作用濃度的升高以及時(shí)間的延長(zhǎng)，槲皮素抑制C33A細(xì)胞的能力也在增強(qiáng)。

此外，細(xì)胞周期結(jié)果顯示，C33A細(xì)胞經(jīng)不同濃度(20、40和80 μmol/L)槲皮素處理48 h后，G0/G1期細(xì)胞百分比明顯增加，而S期細(xì)胞百分比則出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。上述結(jié)果表明，槲皮素可增加G0/G1期細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少S期細(xì)胞數(shù)量，從而抑制C33A細(xì)胞的增殖。同時(shí)，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素可下調(diào)C33A細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達(dá)。因此，推測(cè)槲皮素可能是通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中Cyclin D1蛋白的表達(dá)，阻斷細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制C33A細(xì)胞的增殖和活力。

施劍明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可影響人骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖及凋亡，，與順鉑聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)。本研究中，兩者聯(lián)合作用于C33A細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞活力分別為(31.12±2.835)%和(17.86±3.182)%，作用效果強(qiáng)于相同條件下兩者單獨(dú)使用，提示槲皮素可增強(qiáng)順鉑對(duì)C33A細(xì)胞的敏感性，與順鉑具有協(xié)同效應(yīng)。

Caspase-3 和Caspase-9作為凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。有研究[13]證實(shí)，槲皮素可通過(guò)上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡。本研究中，Western Blot結(jié)果顯示，槲皮素增加C33A細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表達(dá)。因此，推測(cè)槲皮素可能通過(guò)提高Caspase-3 和Caspase-9的表達(dá)，促進(jìn)C33A細(xì)胞凋亡。

綜上所述，槲皮素可能通過(guò)調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白Cyclin D1以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表達(dá)，抑制C33A細(xì)胞的增殖和活力；槲皮素還可以增強(qiáng)順鉑對(duì)C33A細(xì)胞的敏感性，與順鉑具有協(xié)同效應(yīng)，相關(guān)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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