肝癌患者血清乙肝病毒e抗原與肝細胞HBV cccDNA水平的相關性

我國原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)男性及女性病死率在所有惡性腫瘤中分別排第4和第5位[1-2]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC的重要病因之一[3]，與血清HBV DNA陰性肝炎患者相比，當HBV DNA>20 000 U/mL時，患者發生肝硬化和HCC的風險分別增加10倍和9倍[4]；同時肝癌患者HBV復制水平與患者預后密切相關，高HBV DNA水平HCC患者預后更差、更易復發[5]。抗病毒治療可以降低病毒攜帶者HCC發生率[6]，并顯著改善HCC患者預后[7]。因此，監測HCC患者HBV復制水平對于指導肝癌患者的抗病毒治療具有重要的臨床意義[8]。

肝細胞內HBV病毒基因組包括松弛環狀DNA(relax circular DNA，rcDNA)和共價閉合環狀DNA(covalently closed circularDNA, cccDNA)，其中cccDNA是HBV復制的原始模板，肝細胞cccDNA定量是評價抗病毒藥物療效的金指標[9]。近年來，臨床研究[10]和體外研究[11]均表明慢乙肝患者HBeAg與cccDNA具有良好的相關性。因此，本研究主要探討HCC患者血清HBeAg與肝細胞HBV DNA及cccDNA的關系，并使用血清學指標構建預測組織HBV DNA及cccDNA的多元回歸模型，為更好地評價HCC患者肝細胞HBV DNA及cccDNA水平提供依據。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 收集2012～2015年在解放軍第105醫院接受肝癌切除術的HCC患者96例，HCC患者癌組織及癌旁組織均術中收集并保存于-80℃冰箱備用，癌旁組織為距離癌組織切緣2～3 cm切下的約0.5 cm3的樣本。本研究經解放軍第105醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。納入標準：所有HCC患者均經組織病理確診，同時滿足HBsAg陽性，血清HBV DNA>1 000 U/mL，無抗病毒用藥史。排除標準：合并或其他肝炎病毒(如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等)感染、肝移植、血液病或其他實體腫瘤。

1.2 血清標志物檢測 使用雅培i2000全自動化學發光分析儀(Abbott，美國)及其配套試劑[Abbott,美國；試劑批號：乙肝表面抗原(43417LF00)，乙肝表面抗體(37323LF00)，HBeAg(34833LI00)，HBeAb(33798LI00)，乙肝核心抗體(33674LI00)]檢測HBV感染標志物。

1.3 血清HBV DNA及肝細胞HBV DNA、cccDNA檢測 使用QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN，德國)提取血清及組織HBV DNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀(Life Technologies Corporation，美國)檢測血清HBV DNA及組織cccDNA。定量檢測方法參考文獻[12]，使用質粒安全ATP依賴的NDA酶處理肝細胞總DNA，獲得HBV DNA及cccDNA，使用Taqman熒光探針PCR法檢測HBV DNA及HBV cccDNA，使用引物F1和R1，TaqMan探針P1，對組織HBV cccDNA進行定量，使用引物F2和R2，TaqMan探針P2對組織HBV DNA進行定量。組織內HBV DNA和cccDNA定量均參考組織甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GADPH)定量進行標準化[13]，各引物序列詳見表1。

表1 肝細胞HBV DNA及cccDNA定量檢測引物列表

1.4 分組及觀察指標 根據HBV感染階段將HCC患者分成3組：HBeAg(﹢)/HBeAb(-)組、HBeAg(﹢)/HBeAb(﹢)組及HBeAg(-)/HBeAb(﹢)組，比較3組血清、肝癌組織及癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平的差異。

2 結果

2.1 不同HBV感染階段HCC患者組織HBV DNA及cccDNA水平比較 不同HBV感染階段HCC患者年齡、性別存在差異，但各組腫瘤病理學指標差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。HBeAg(+)/HBeAb(-)組血清HBV DNA、癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(-)組癌旁組織cccDNA高于HBeAg(+)/HBeAb(+)組(P<0.05)，HBeAg(+)/HBeAb(+)組癌組織中HBV DNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組(P<0.05)。詳見表3。

表2 不同HBV感染階段HCC患者基本信息

指標HBeAg(+)/HBeAb(-)組(n=20)HBeAg(+)/HBeAb(+)組(n=18)HBeAg(-)/HBeAb(+)組(n=58)F值P值癌組織cccDNA(log10U/106cells)3.4±1.64.5±1.63.5±1.4#3.8190.026癌組織HBVDNA(log10U/106cells)5.7±0.86.0±1.25.5±1.42.8490.063癌旁組織cccDNA(log10U/106cells)5.4±1.34.1±1.2*4.2±0.9*5.7830.004癌旁組織HBVDNA(log10U/106cells)7.0±1.56.3±1.25.7±1.0*6.2310.002血清HBVDNA(log10U/mL)5.5±1.15.0±1.04.5±1.0*13.389<0.001

2.2 肝癌患者血清HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA的關系 HCC患者血清HBeAg與癌旁組織 HBV DNA(r=0.476，P<0.001，圖1A)及cccDNA(r=0.549，P<0.001，圖1C)存在相關性，與癌組織HBV DNA(r=0.064，P=0.540)、癌組織cccDNA(r=0.132，P=0.219)無相關性。同時血清HBV DNA與癌旁組織 HBV DNA(r=0.440，P<0.001，圖1B)及cccDNA(r=0.359，P<0.001，圖1D)存在相關性，但與癌組織中HBV DNA(r=0.047，P=0.652)及cccDNA(r=0.129，P=0.230)無相關性。詳見圖1。

圖1 HCC患者血清HBeAg、HBV DNA與肝細胞組織HBV DNA和cccDNA的相關性

2.3 不同TNM分期肝癌HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA關系 肝癌患者血清HBeAg與癌旁組織中cccDNA 和HBV DNA均存在相關性(P<0.05)，與癌組織cccDNA及HBV DNA水平無相關性(P>0.05)，而血清HBV DNA僅在TNM I期及III期患者與癌旁組織cccDNA及HBV DNA存在相關性(P<0.05)。詳見表4。

2.4 癌旁組織HBV DNA及cccDNA的預測模型構建 使用血清學指標利用多元回歸模型預測癌旁組織HBV DNA及cccDNA，使用HBeAg、血清HBV DNA及乙肝核心抗體(hepatitis B core antibody，HBcAb)可以預測癌旁組織HBV DNA(R2=0.549)及cccDNA(R2=0.542)，回歸方程為：癌旁組織HBV DNA= 5.422+ 0.551×血清HBV DNA+0.308×HBeAg+0.239×HBcAb，癌旁組織cccDNA=0.525+0.439×血清HBV DNA+0.436×HBeAg+0.168×HBcAb。詳見表5。

3 討論

HBV cccDNA 是HBV前基因組RNA(pregenome mRNA, pgmRNA)復制的原始模板，是HBV循環復制以及持續感染的關鍵因素[14]。現有核苷(酸)類似物無法直接作用于cccDNA，肝細胞cccDNA的存在是HBV病毒難以清除的關鍵因素[15]，故肝細胞cccDNA水平對于HCC患者抗病毒治療的監測具有重要意義。但由于肝活檢監測肝組織中cccDNA水平還存在一定的困難，故探討能反映其水平的非侵入性替代檢測指標具有重要意義。

表4 不同分期HCC患者血清HBeAg、HBV DNA與肝HBV DNA相關性分析

表5 癌旁組織HBV DNA和cccDNA的多元回歸分析

本研究中，不同感染階段HCC患者血清HBV DNA、癌旁組織HBV DNA及cccDNA水平存在差異，HBeAg(+)/HBeAb(-)組高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組，且隨著患者免疫狀態由HBeAg陽性向陰性轉換而降低；HBeAg(+)/HBeAb(-)組HCC患者癌旁組織中cccDNA水平高于HBeAg(+)/HBeAb(+)組，而HBeAg(+)/HBeAb(+)組與HBeAg(-)/HBeAb(+)組癌旁組織cccDNA水平無顯著改變，這與相關研究[10-11，16]結果一致，表明進入血清轉換狀態后，患者cccDNA水平趨于穩定。HBeAg(+)/HBeAb(+)組患者癌組織中HBV DNA和cccDNA高于HBeAg(-)/HBeAb(+)組，表明在不同感染階段，癌組織與癌旁組織HBV DNA的變化還受病毒所處組織微環境的影響。

HBV復制周期中，以cccDNA為模板合成pgmRNA，其前C/C區既是HBcAg的模板，也是HBeAg合成的模板[17]，故cccDNA水平直接決定了HBcAg及HBeAg的水平。本研究表明，HCC患者中HBeAg與癌旁組織HBV DNA和cccDNA有相關性，HBeAg與癌組織中HBV DNA和cccDNA水平無相關性，可能原因包括：①血清HBeAg主要源于癌旁組織，癌旁組織反映的是整個肝臟的狀況，而癌組織僅占肝臟的較小部分；②這可能與乙肝相關肝癌時期病毒復制周期改變有關，在慢乙肝患者或癌旁組織中，乙肝病毒基因復制、成熟及分泌整個過程有條不紊，HBV DNA復制水平與前C/C基因表達水平較為一致，而在癌組織，這種一致性很可能被打破[17]，從而表現為HBeAg與癌旁組織中指標呈相關性，而與癌組織中指標無相關性。近年來，乙肝c相關抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg )被證明與乙肝患者肝內cccDNA具有較好的相關性[18-19]，但其臨床應用仍然有限，相比而言，HBeAg檢測應用更為廣泛，更便于臨床應用。

此外，本研究進一步分析了不同TNM分期HCC患者HBeAg與組織HBV DNA及cccDNA的相關性，結果表明，HBeAg均與癌旁組織HBV DNA和cccDNA顯著相關，盡管TNM I期與III期患者血清HBV DNA與組織HBV DNA和cccDNA相關系數更高，但II期患者血清HBV DNA與癌旁組織HBV DNA和cccDNA無相關性，表明血清HBeAg水平對于組織HBV DNA和cccDNA水平的監測具有較好的穩定性。

最后，我們使用了HBV感染的血清學指標構建了癌旁組織HBV DNA及cccDNA的預測模型，可以預測癌旁組織HBV DNA及cccDNA的變化，R2分別為0.549及0.542，表明上述指標與組織HBV DNA均具有一定的相關性，本研究中血清HBV DNA與HBeAg均與癌旁組織HBV DNA及cccDNA有相關性，而HBcAb與癌旁組織HBV DNA及cccDNA無相關性。但既往研究[20]表明，HBcAb可單獨預測HBeAg血清轉換，與cccDNA具有相似的意義，故進入了組織HBV DNA的預測模型，同時使用多變量回歸模型預測癌旁組織HBV DNA及cccDNA優于使用單個指標(單獨使用血清HBV DNA及HBeAg預測時，R2均<0.4)，未來納入更多變量時，其預測效果可進一步提高。

綜上所述，不同HBV感染階段HCC患者其癌旁組織HBV DNA和cccDNA水平差異有統計學意義，血清HBeAg及HBV DNA與癌旁組織HBV DNA和cccDNA具有較好的相關性，且血清HBeAg與癌旁組織HBV DNA和cccDNA顯著相關，不受TNM分期影響，使用血清學指標構建的組織HBV DNA和cccDNA回歸模型，可用于預測組織HBV DNA和cccDNA變化，更易于臨床檢測，故可以更好地監測HCC患者HBV感染狀況，為HCC患者抗病毒治療提供更多指導。

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