EB病毒感染患兒淋巴細胞亞群特征和EBV DNA載量分析

榮婷婷， 王維維， 王娟娟， 章黎華， 沈立松

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科，上海 200092）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒。有文獻報道，全世界約有90%的人曾感染過EBV[1]。EBV感染在兒科臨床很常見，學齡前期及學齡期兒童多以傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）為表現(xiàn)。IM的特征是患者有大量的單個核細胞增生，其中主要是EBV特異性CD8+細胞毒性T細胞的增殖、活化[2]。而兒童慢性活動性EB病毒（chronic active Epstein-Barr virus，CAEBV）感染的病情與IM比較，更嚴重且容易反復，嚴重者會出現(xiàn)多器官衰竭而導致死亡[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，T細胞、B細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等在不同疾病轉(zhuǎn)歸的EBV感染患兒中的變化特點不同[4-5]。另據(jù)報道，IM患兒血清EBV DNA載量與疾病的嚴重程度相關(guān)[6]，DNA的血清載量分析對于診斷CAEBV感染也非常有意義[7]。

本研究旨在采用流式細胞術(shù)分析IM和CAEBV感染患兒的淋巴細胞表型，并對免疫細胞亞群進行定量檢測，分析IM和CAEBV感染患兒免疫狀態(tài)的特點，又通過檢測血清EBV DNA載量了解不同疾病狀態(tài)下病毒的活動情況，從而為IM與CAEBV感染2種疾病的鑒別診斷提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1—12月在上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院診治且進行過淋巴細胞亞群檢測的EBV感染患兒35例，其中IM患兒（IM組）17例（男10例，女7例，年齡1～4歲）、CAEBV患兒（CAEBV組）18例（男15例，女3例，年齡3～14歲）。以同期上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院體檢健康兒童15名（男10例，女5例，年齡5～14歲）作為健康對照組。

IM診斷標準：（1）以急性發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大、肝脾大等為主要臨床表現(xiàn)；（2）淋巴細胞比例增加（＞50%），異形淋巴細胞比例增加（＞10%）；（3）EBV衣殼抗原（viral-capsid antigen，VCA）免疫球蛋白M（immunoglobulin，IgM）陽性和／或外周血EBV DNA陽性；（4）除外巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等感染。CAEBV感染的診斷標準參照OKANO等[8]建議的標準：（1）臨床表現(xiàn)為持續(xù)或復發(fā)性IM樣癥狀；（2）異常的EBV VCA抗體和早期抗原（early antigen，EA）抗體滴度升高和/或受累組織及外周血EBV DNA增加；（3）慢性病程無法用其他已知疾病解釋。

1.2 方法

1.2.1 各淋巴細胞及其亞群比例的檢測 采用FACSC anto型流式細胞分析儀及配套試劑（美國BD公司）測定T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+以及CD19+淋巴細胞和CD56+CD16+NK細胞的比例和計數(shù)。

1.2.2 EBV DNA的定量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測EBV DNA載量，試劑由湖南圣湘基因股份有限公司生產(chǎn)，MX3000實時熒光檢測系統(tǒng)購自上海吉泰生物科技有限公司。嚴格按儀器和試劑說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，非正態(tài)分布資料或等級資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IM組與CAEBV組血清EBV抗體與EBV DNA載量比較

IM組EBV VCA IgM陽性15例，陰性2例；EBV VCA IgG陽性16例，陰性1例；EBV DNA均為陽性，載量為3.60（1.50，7.15）×103拷貝/mL。CAEBV組EBV VCA IgM抗體、EBV VCA IgG抗體均陽性14例，EBV VCA IgM抗體陰性而EBV VCA IgG抗體陽性4例；EBV DNA均為陽性，載量為1.25（0.19，2.95）×104拷貝/mL。IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。

2.2 IM組、CAEBV組和健康對照組淋巴細胞比例和計數(shù)的比較

IM組淋巴細胞比例和計數(shù)最高，中位數(shù)分別為65.90%和7 610個/μL，CAEBV組淋巴細胞比例的中位數(shù)為48.40%，也高于健康對照組（29.71%），而CAEBV組的淋巴細胞計數(shù)較健康對照組升高不明顯。見表1。

2.3 IM組、CAEBV組和健康對照組B、NK、CD4+T和CD8+T細胞比例和計數(shù)的比較

IM組B、NK、CD4+T、CD8+T 4種淋巴細胞亞群呈現(xiàn)不同的變化，CD8+T細胞明顯增加，比例和計數(shù)的中位數(shù)分別為61.50%和517 個/μL，均顯著高于健康對照組和CAEBV組（P＜0.05）；B、NK、CD4+T 3種細胞的比例與健康對照組比較均顯著降低（P＜0.05），但3種細胞的計數(shù)均增加（P＜0.05）。CAEBV組僅NK細胞比例較健康對照組出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），其余差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。值得注意的是，CAEBV組與IM組比較，CD4+T細胞的比例升高而計數(shù)下降，而CD8+T細胞的比例和計數(shù)明顯降低，2個組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 EBV DNA載量與淋巴細胞亞群的相關(guān)性

IM組和CAEBV組EBV DNA載量與淋巴細胞亞群無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表1 健康對照組、IM組和CAEBV組外周血淋巴細胞比例及計數(shù) [M（P25，P75）]

表2 健康對照組、IM組和CAEBV組外周血B、NK細胞比例及計數(shù) [M（P25，P75）]

表3 EBV DNA載量與淋巴細胞亞群的相關(guān)性

3 討論

EBV被國際癌癥研究機構(gòu)歸為I類致癌物質(zhì)，是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒，屬皰疹病毒屬，具有潛伏和轉(zhuǎn)化的特性[9]。有研究結(jié)果顯示，EBV感染可導致機體細胞免疫功能的不足和缺乏，可直接引起IM，同時可使T細胞、B細胞、NK細胞具備無限增殖和轉(zhuǎn)化為惡性疾病的能力，并與若干惡性腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性[10-12]。機體感染EBV后，細胞免疫功能可發(fā)生紊亂，有研究報道證實，原發(fā)性EBV感染的最初靶細胞為B細胞，同時B細胞也成為病毒終生潛伏的場所[13]。B細胞介導了原發(fā)性、持續(xù)性的EBV感染，感染EBV后能無限增殖。在機體免疫狀態(tài)正常的情況下，這種增殖的B細胞會刺激T細胞的免疫反應，將感染EBV的B細胞殺滅，從而起到清除病毒的作用。而IM患兒的外周血出現(xiàn)的異形淋巴細胞并不是由病毒復制直接引起的，而是T細胞免疫反應的結(jié)果[14]。HOSHINO等[15]曾對急性EBV感染的患兒進行連續(xù)抽血檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBV的量與特異性的CD8+細胞毒性T細胞的量密切相關(guān)。CD4+/CD8+比值是重要的反映免疫狀態(tài)的檢測指標，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關(guān)。IM和CAEBV感染同為EBV感染，但CAEBV感染病情較重且容易反復，預后不良，嚴重者會導致死亡，且一些CAEBV感染患者有過IM或類似IM癥狀。因此，臨床上早期鑒別診斷IM與CAEBV感染很重要，可提早進行恰當?shù)母深A和治療，防止病情惡化。

EBV抗體測定是診斷IM與CAEBV感染的重要手段。本研究結(jié)果顯示，大部分EBV感染患兒均出現(xiàn)了EBV抗體的升高，但也有個別病例并未發(fā)現(xiàn)抗體水平升高，并且IM患兒和CAEBV感染患兒在抗體表達上難以發(fā)現(xiàn)明顯差異，抗體滴度的變化僅能作為EBV感染的輔助診斷。本研究結(jié)果顯示，IM淋巴細胞比例和計數(shù)均明顯升高，最主要原因是CD8+T細胞的比例和計數(shù)大幅上升，而CAEBV組淋巴細胞比例有升高，但CD4+T細胞及CD8+T細胞與健康對照組相比變化不顯著，B細胞和NK細胞比例和計數(shù)也未出現(xiàn)明顯降低，這與以往關(guān)于成人的文獻報道[16]有所不同，原因可能是本研究較早期地對CAEBV感染患兒的淋巴細胞亞群特征進行了監(jiān)測，患兒的免疫細胞功能還未出現(xiàn)明顯下調(diào)，另外兒童與成人對于EBV感染的免疫應答可能存在不同之處，尚需進一步研究。本研究中CAEBV組與IM組比較，B細胞計數(shù)變化無明顯差異，NK細胞降低，與以往文獻報道[17]也有所不同，但CD8+T細胞的變化與文獻報道[17]一致，進一步證明了IM患者CD8+細胞毒性T細胞的大量增殖導致了病毒的清除，而CAEBV感染患者存在這種免疫反應的缺陷，使病毒無法得到有效清除，臨床上表現(xiàn)為病情重且遷延不愈，甚至進一步發(fā)展為淋巴瘤或白血病，預后差的結(jié)論。本研究同時還分析了2種EBV感染疾病患兒的EBV DNA載量差異，結(jié)果顯示IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。依據(jù)本研究的結(jié)果，對于臨床上早期初診EBV感染的患兒，如果CD8+T細胞的比例和計數(shù)沒有大幅上升并且EBV DNA載量又比較高，應警惕其為CAEBV感染患兒，臨床上應引起足夠重視。由于本研究選擇樣本為小樣本，研究結(jié)果還需要進一步驗證。尤其對于EBV DNA載量與患兒淋巴細胞亞群特征的相關(guān)性還需要大樣本數(shù)據(jù)進一步分析。

綜上所述，臨床上對于確診為EBV感染的患兒可以根據(jù)淋巴細胞亞群分析和EBV DNA載量測定輔助鑒別診斷IM和CAEBV感染，以便及時調(diào)整治療方案，避免患兒病情加重。

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