營養鹽限制對利瑪原甲藻生長和產毒的影響

曾 玲，龍 超，文 菁

（1.嶺南師范學院化學化工學院，廣東 湛江 524048；2.中國科學院南海海洋研究所/海洋生物資源可持續利用重點實驗室，廣東 廣州 510301；3.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

有害藻華 （Harmful Algal Blooms，HABs）破壞了生態平衡，對人類健康和漁業經濟等造成影響，是世界范圍內備受關注的海洋環境問題［1］。利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）是一種世界范圍內廣泛分布且能暴發赤潮［2］的底棲附生甲藻，其產生的腹瀉性貝毒（主要成分為岡田酸，Okadaic acid，OA）被魚、蝦、貝等攝食后在體內累積，通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒。隨著大規模赤潮的頻繁暴發和食用海產品導致中毒事件的發生，微藻的生長和產毒機制日益受到重視。研究微藻生長條件及其產毒機制不但有利于減少赤潮與毒素的環境公害，而且可使其結構獨特的次生代謝產物為人類所利用，對保障水產品安全和人類生命安全具有重要意義［3］。

影響微藻生長和代謝產物的主要因子有氮、磷等營養元素。研究表明，氮、磷營養鹽濃度對微藻的生長和產毒有顯著影響［4-6］。氮、磷濃度與藻細胞生長速率往往呈正相關關系。然而，氮、磷濃度過高或過低均對藻細胞生長具有顯著的抑制效應［7］，低濃度氮、磷往往有利于毒素的合成和累積［4，8-9］。有關營養鹽對P.lima生長和產毒影響的研究主要集中在溫帶種［4，9-14］。目前尚未有關于營養鹽對熱帶P.lima生長和產毒影響的研究。此外，前人在研究氮、磷對 P.lima 生長和產毒的影響中［4，9，14］，用的是f/2配方，該配方氮源只有NaNO3沒有NH4Cl，或者是單獨以NaNO3、NH4Cl作為氮源進行研究。本研究采用改良K配方（含NaNO3和 NH4Cl）［15］，通過設定氮限制（1/2-N，1/4-N，1/8-N，1/16-N，1/32-N）和磷限制（1/2-P，1/4-P，1/8-P，1/16-P，1/32-P），對1株來自三亞海域的熱帶P.lima生長和產毒的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 藻培養

P.lima 分離自海南三亞（18°14′N ，109°31′E），用改良K配方的培養液進行分離純化培養，試驗于中國科學院南海海洋研究所海洋生物資源可持續利用重點實驗室進行。培養溫度28（±1）℃，光暗周期13L∶11D，鹽度30‰，光源為白色日光燈，光照強度約為4 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 N、P濃度設置 以改良K配方中的N、P營養鹽為基礎，固定N濃度，改變P濃度進行試驗；同理，固定P濃度，改變N濃度進行試驗。分別設置6個濃度梯度：1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32（表1）。取處于指數生長期、生長狀況良好的藻細胞，離心，去掉原培養液，加入滅菌海水洗滌沉淀藻細胞，離心，重復上述步驟，共洗滌藻細胞3次，以除去原培養液中的營養鹽。將洗滌好的藻細胞接種于800 mL培養液中，接種密度650 cells/mL。試驗藻種培養所用培養液中除N、P濃度外，其余元素與K培養液相同。

表1 N、P濃度梯度的設置

1.2.2 藻密度的測定和生長率的計算 每天在同一時間段取樣。藻細胞用Lugol試液固定后，于Nikon TS100倒置顯微鏡下進行細胞計數。每個樣品計數3次，取平均值，根據計數值繪制生長曲線，并根據Guillard的單細胞藻種群生長公式［16］計算藻細胞生長率：

式中，N0為藻細胞初始密度，Nt為t天后藻細胞密度，t為培養天數。

1.2.3 殘留N、P含量分析 海水的營養鹽濃度用注射式營養鹽自動分析儀（Lachat Inc.，QuichChem 8500，USA）測定，N通過鎘柱將硝氮還原為亞硝氮，再用磺胺和N-1-鹽酸奈乙二胺顯色法進行測定；的測定采用靛酚藍分光光度法；的測定采用以抗壞血酸為還原劑的鉬藍顯色法。

1.2.4 葉綠素a含量測定 吸取6 mL充分混勻后的藻液至10 mL離心管，5 000 r/min離心5 min，棄上清，加入6 mL 80%丙酮，混勻，置于4℃冰箱黑暗抽提24 h，5 000 r/min離心10 min，取上清進行測定。測定波長為663、645 nm，以80%丙酮溶液作參比，根據公式Ca =12.71A663-2.59A645，計算葉綠素a含量。

1.2.5 毒素含量測定 毒素提取參考Quilliam等［17］的方法進行。在收集有藻細胞的離心管中加入0.5 mL Tris-HCl和1 mL甲醇，超聲波提取1 min，3 500 r/min離心10 min，將上清轉移至另一干凈離心管；往原離心管加1 mL甲醇，漩渦振蕩器上震蕩5 min，然后3 500 r/min離心10 min，收集上清；重復上一步操作，共得離心上清液3.5 mL。適當稀釋后用美國的Aabraxis公司的岡田酸（OA）試劑盒進行毒素檢測。

試驗數據采用SPSS軟件進行差異顯著性、相關性分析。

2 結果與分析

2.1 N、P在培養液中的殘留濃度

表2 N、P在培養液中的殘留濃度

2.2 N、P限制對P.lima生長的影響

2.2.1 N、P限制對生長曲線和細胞密度的影響 N限制處理P.lima的生長曲線如圖1a所示。各培養組藻細胞在接種后即進入指數生長期，隨著N濃度限制程度的增大，細胞終密度減小，各生長曲線依次走低，呈現梯度。最佳生長是對照組，生長曲線位于最上層，細胞終密度在6個處理中最大，約3×104cells/mL。細胞終密度隨著N濃度限制的增強而減小 （3×104～0.65×104cells/mL；P< 0.001），1/32N 限制的培養組增殖程度最小，穩定期藻密度停留在較低水平（0.65×104cells/mL），細胞終密度只有對照的1/5。隨著N濃度的減小，指數期相應變短。

圖1 營養限制條件下P.lima的生長曲線

P限制處理P.lima的生長曲線如圖1B所示。隨著P濃度限制程度的增大，細胞終密度逐級減小（3×104～0.23×104cells/mL，P<0.001），各生長曲線依次走低，呈現梯度。藻細胞增殖程度最低的是1/32P，生長曲線在第6 d后幾乎與橫坐標平行，細胞終密度停留在0.23×104cells/mL，是1/32N處理（0.65×104cells/mL）的1/3，僅達到對照（3×104cells/mL）的1/13。P限制對P.lima生長影響顯著，1/2P～1/32P藻密度急劇下降（下降幅度>50%，P<0.001）。

同一限制水平下，N限制處理的細胞終密度比P限制的高。數據分析表明，細胞密度與N、P濃度密切相關，皮爾森相關系數分別為0.862、0.998，顯然P濃度與細胞終密度的關系更密切。

2.2.2 N、P限制對生長速率的影響 不同營養限制條件下P.lima的生長速率見圖2。基于每次藻細胞計數值繪制的生長曲線（圖2A、圖2B），所有處理的P.lima生長速率均隨著培養時間的延長波動下降。N限制條件下，不同處理生長速率持續下降的時間不同，對照出現在培養12 d，1/2N、1/4N和1/8N出現在培養9 d，1/16N出現在培養6 d，據此推測限制程度越大，生長速率持續下降的時間越早。1/32N在培養9 d生長速率幾乎為0，說明培養6～9 d細胞分裂尚未完成，未能出現增長。

P限制條件下，除了對照和1/2P處理，其余各處理的P.lima生長速率均在培養3 d開始急劇下降，1/16P和1/32P在培養12 d接近0，1/4P和1/8P在培養18 d接近0，1/2P在培養21 d接近0，而對照的P.lima生長速率接近0的時間是培養24 d，說明隨著P限制程度的增大，藻細胞停止生長的時間提前。

整個生長周期的平均生長速率如圖2C、圖2D所示。N限制條件下，隨著限制程度增大各處理的P.lima生長速率逐級降低（0.128～0.082 /d），差異極顯著。P限制條件下，生長速率范圍為0.047～0.133 /d，也隨著營養限制的增大而逐級減小，各處理結果間差異極顯著。平均生長速率與N、P濃度密切相關，皮爾森相關系數分別為0.857、0.905。

圖2 不同營養限制條件下P.lima的生長速率

圖3 N、P限制下單位體積葉綠素a含量（A）和單位細胞葉綠素a含量（B）

2.2.3 N、P限制對葉綠素a含量的影響 對各處理穩定期培養液中的葉綠素a含量進行測定，結果（圖3A）表明，對照的葉綠素a含量最高（1.217 mg/L），1/32限制處理最低（1/32N：0.209 mg/L；1/32P：0.161 mg/L），隨著N、P濃度的逐級減小，各處理藻液中單位體積葉綠素a含量逐級下降。單位體積葉綠素a含量與N、P濃度密切相關（P< 0.05，皮爾森相關系數：N限制0.975，P限制 0.972），說明培養液中N、P濃度受限制會影響藻細胞中葉綠素a的含量。單位體積葉綠素a含量與細胞終密度密切相關（P< 0.05，皮爾森相關系數：N限制0.931，P限制 0.971）。

單位細胞葉綠素a含量如圖3B所示。N限制處理（1/2N～1/32N）單位細胞葉綠素a含量低于對照，差異不顯著。P限制條件下，單位細胞葉綠素a含量高于對照，差異極顯著，其中1/32P的濃度最高 （70.02 pg/cell）。N限制處理單位細胞葉綠素a 含量顯著低于P限制處理，可能是因為N是葉綠素合成的重要元素，N缺乏阻止了葉綠素a的合成。

2.3 N、P限制對P.lima產毒的影響

圖4 N、P處理下P.lima單位細胞毒素含量

由圖4可知，N限制條件下，各處理（1/2N～1/32N）的OA含量均比對照高，其中含量最高的是1/32N（41.30 pg/cell），比對照（13.18 pg/cell）高2倍多；前3個處理（1/2N、1/4N和1/8N）毒素升高幅度不明顯，1/16N和1/32N的OA含量大幅度升高，導致N限制條件下各處理結果差異極顯著。P限制條件下，1/2P處理的OA含量（13.02 pg/cell）與對照（13.18 pg/cell）幾乎相等，其余處理均比對照高，其中1/16P（41.93 pg/cell）和 1/32P（42.16 pg/cell）極顯著高于對照，其OA含量是對照的3倍多。前3個處理（1/2P、1/4P和1/8P）和對照之間OA含量差異不顯著；后2個處理（1/16P和1/32P）之間差異不顯著；但前4個處理和后2個處理之間差異極顯著。OA濃度與生長速率呈負相關，N限制、P限制下的斯皮爾曼等級相關系數分別為-0.943、-0.886，即當生長速率下降時OA濃度升高。N限制處理的OA含量和P限制處理有兩個共同點：（1）1/16和1/32處理OA含量大幅度上升；（2）OA最高含量均出現在1/32處理。

3 結論與討論

3.1 N、P殘留的濃度

N、P殘留的濃度揭示了藻細胞對其吸收的狀況，殘留越多，吸收越少，反之，殘留越少，吸收越多。本研究結果表明，隨著P限制的增強，的殘留量升高，這與 Vanucci等［8］的研究結果一致，即當N面臨強烈的P限制時，培養液中殘留的N會增多。P限制條件下，殘留的含量（< 4.7 μmol/L）遠低于含量（>17.05 μmol/L），這可能是吸收的比快的原因［4］，的吸收發生在被消耗之后［18］。與其他N源相比，P.lima和其他原甲藻更傾向于吸收一般來說，對的偏好在底棲鞭毛藻中是常見的，因為是在底棲生境中隨時可用的還原性氮源［18，21］，但濃度過高會對 P.lima 有毒害作用，降低其生長速率和產毒量［4］。

3.2 N、P限制對葉綠素a含量的影響

N是葉綠素的主要成分，直接或間接影響光合作用；P 是構成ATP、GTP、核酸、磷脂、輔酶的最基本元素。適宜的N、P濃度有利于藻細胞生長和葉綠素a含量的增加［22］；濃度過低會對藻細胞生長和葉綠素a的含量造成影響［7，22］。本研究表明，隨著 N、P 濃度的降低，藻生長受限，單位體積葉綠素a含量減少。除了N、P濃度會對葉綠素a含量造成影響外，光照強度、CO2和pH值、銨氮等也是影響葉綠素a含量的因素。低光照強度會誘導細胞產生更多的葉綠素 a［4］；Aikman 等［19］研究發現，在低CO2和高pH值的條件下，P.hoffmannianum的葉綠素a含量降低，CO2的缺乏抑制了光合作用的合成；過高的銨氮濃度對藻細胞有毒害作用，抑制藻的光合活性和氧化反應，導致葉綠素a含量降低［4］。

N、P 質量濃度對綠色顫藻（Oscillatoria chlorine）葉綠素a質量濃度的影響顯著，其中主要影響因子是N［22］。本研究發現，N限制處理的單位細胞葉綠素a 含量遠低于P限制處理，這可能是由于葉綠素a的分子結構中不含有P元素，P不像N那樣直接參葉綠素a的合成，因此，當培養液中N受到限制，葉綠素a合成減少，而P限制條件下，N源充足，有足夠的N用于葉綠素a的合成。同一培養條件下，不同P.lima藻株單位細胞葉綠素a含量存在差異，Morton等［23］研究表明，來自N位點的A249 藻株葉綠素a含量顯著高于其余5種藻株，本研究中對照的葉綠素a含量與上述研究的A249無顯著差異，高于Varkitzi等和Nascimento等研究的 P.lima 藻株［4，24］。

3.3 N、P限制對P.lima生長的影響

微藻的生長依賴于營養物質的供給［4，9］。N和P是微藻生長所必需的主要元素，不同N、P 營養鹽水平對微藻生長影響顯著［7，25-26］。N、P起始濃度影響微藻的生長，與藻細胞生長速率往往呈正相關［4，7］。過高或過低的N、P濃度對藻細胞生長表現出顯著的抑制效應［7］。本研究表明，隨著N、P起始濃度的降低，P.lima各生長指標（生長速率、細胞終密度、單位體積葉綠素a含量）下降，表現出明顯的生長抑制。Vanucci等［9］的研究結果也證實了低N、P濃度會抑制P.lima的生長。

營養鹽限制尤其是P 限制能夠顯著降低藻細胞的比生長速率和細胞密度，縮短藻細胞指數生長期和穩定期的持續時間［26］。網狀原角藻的生長更多地受P 限制的影響而不是N 限制［26-28］，在本研究及其他一些DSP產毒藻［29-31］和 PSP產毒藻［32-33］中亦證明了 P對藻的生長影響比N更大。然而，與上述藻不同，N對Ostreopsis cf.ovata生長的影響比P大［34］。N限制對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）的生長有明顯抑制作用，而磷限制則沒有［35］。也有些藻對N、P營養限制均不敏感，如惠氏微囊藻在不同N、P起始濃度下，除了低磷濃度（1/100）處理外，其余濃度處理的生長速率并未表現出顯著影響［7］。

3.4 N、P限制對P.lima 產毒的影響

甲藻對營養物質吸收的能力低于其他藻類，在營養缺乏條件下，其競爭能力會比其他硅藻和無毒甲藻差，而毒素的產生可能是甲藻對低營養利用率的一種補償性競爭策略，可以作為對攝食浮游藻類生物的威懾，防止被攝食；當營養不平衡時，毒素作為營養儲存化合物，可以減輕某些過剩營養物質對藻造成的不利影響［26］。有研究表明，在營養平衡的條件下，藻類產毒量往往較低；而當營養失衡，尤其低N、P濃度條件能夠刺激藻類產毒增加［4，8-9］，本研究結果也支持上述觀點。低P濃度條件下比低N 濃度更能促進毒素的累積［9，26，36］。胡蓉等［37］研究發現，培養液中不添加P時，鏈狀裸甲藻的產毒量最大、達3.3 pg/cell，P限制可以促進鏈狀裸甲藻細胞中PSP毒素的產生。P濃度對2種甲藻塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）和微小亞歷山大藻（Alexandtium minutum）的生長和產毒能力均有顯著性影響，此兩種藻均在0 μmol/L 磷濃度下產毒能力最高［38］。DSP 是一類聚醚類或大環內酯類化合物，其結構中不含磷，磷鹽直接參與DSP生物合成的可能性很小。磷鹽對DSP合成的影響可能與該藻類在磷鹽條件下的生長狀況有關［39］，它可能通過影響微囊藻的生長或者其他途徑來影響藻毒素的合成［40］。

雖然 N 限制會促使 DSP 產量增加［4，9，12］，但會抑制PSP的產量［31-32］和Ostreopsis cf.ovata的毒素產量［34］，這是由于毒素組成元素不同，對營養限制的反應也有所不同［34］。Van等［41］研究發現，N和P限制對富含N的毒素會產生相反效果：N限制條件下毒素含量下降，P限制條件下毒素含量增加。N限制對銅綠微囊藻的產毒有明顯抑制作用，而P限制對其產毒影響不大［35］。然而，無論N限制還是P限制對富含C的毒素具有相同的作用效果，均促進了毒素的產生［41］，因為在營養限制的條件下，相對過剩的能量和新合成的有機碳不能用于細胞生長，因而被分流合成富含C的分子如毒素。

在所有營養限制條件下，當細胞生長速度減慢時（進入穩定期），OA的產量均在增加，這是因為雖然細胞生長速率減慢，但OA生成的速率不變，從而使得OA在P.lima中累積，這表明OA的產量受生長的調節［4］，這一結論在其他有毒藻類［42］中也得到證實。本研究中，營養限制越強的處理組生長速率下降得越快，穩定期到來的時間越提前，在同樣培養時間的前提下，OA累積時間越長，因此，限制最強的1/32處理組獲得的OA含量最高。

采用不同培養條件對P.lima產毒研究的結果存在差異。Vanucci等［9］研究中的培養條件為：溫度20℃，光暗周期16L∶8D，鹽度25，90 μmol/m2s，f/2培養基，其結果表明，在N限制條件下，從低限制（1/3N）向強限制（1/50N），OA含量升幅不明顯；P限制下（1/3P～1/50P），OA的峰值出現在1/20P，而不是限制最強的1/50P。本研究〔溫度28（±1）℃，光暗周期13 L∶11 D，鹽度30，光照強度4 000 lx，改良K培養基〕則發現在N、P限制條件下，從低限制（1/2）向強限制（1/32），OA含量增幅明顯，增幅最大的處理（1/32）比限制程度最低的處理（1/2）高出1倍多。毒素的產生受細胞生理條件的調控，這些生理條件受到多種因素的影響（如營養限制），DSP毒素的大量產生可能是一種藻細胞對生理不平衡的非特異性細胞應答［9］。

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