甘薯病毒病脫毒技術的研究進展

何毅文 ，陳珠 ，李育軍 ，何夢海 ，張雄堅 ，植石燦 ，，沈文杰 ，秦樹香 ，，章楷煜 ，倪喬丹

（1.廣東省農業科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣州，510640；2.廣東省農業科學院湛江分院；3.華南農業大學農學院；4.深圳市河田姆生物農業創新有限公司；5.湛江市農業科學研究院）

甘薯以營養繁殖方式繁衍后代，感染病毒后，病毒便不斷蔓延，最終導致種性退化。據調查，甘薯病毒病導致減產25%左右，有的品種減產達50%以上[1]。目前，國內外還沒有有效防治甘薯病毒病的特定農藥，也無高抗病毒病的甘薯品種，因此，利用甘薯脫毒苗是防治甘薯病毒病唯一比較有效的途徑。

1 試管苗培育技術

1.1 試管苗培育歷史概況

植物組織培養技術的發展大概經歷了以下3個階段：①探索階段（1902-1929年）。19世紀初國外科學家利用植物的細胞、胚、器官等組織進行了不同嘗試；1922年，美國醫學家Robbins和德國科學家Kotte率先報道離體培養根尖取得了成功。②組織培養技術理論的建立與發展階段 （1930-1959年）。1934年美國科學家懷特等用番茄的根進行組織培養，首次建立了生長旺盛的無性繁殖系，隨著探究的不斷深入，法國科學家Nobecourt建立了使離體植物組織在人工培養基上不斷生長的培養物，奠定了現代組織培養的基礎。③快速發展和實踐應用階段（1960年以來至今）。20世紀初該項技術建立以來，在理論研究和應用技術上不斷發展，在植物的快速繁殖、品種改良、種質資源保存等方面應用廣泛[2]；日本學者中島和山口于1968年率先進行甘薯組織培養研究，并成功利用離體細胞培養出愈傷組織，由此開啟了組織培養技術在甘薯上的應用[3]。

1.2 試管苗培育方法進展

①培養基上的研究新進展 傳統的植物組織培養技術要求操作環境無菌，操作過程滅菌，因而傳統的方法只適用于實驗室且需要專業人士嚴格把控，無形中增加了實驗成本，不利于技術推廣。隨著研究人員對培養基中營養物質、環境適應性的深入研究，提出增加CO2濃度代替糖作碳源，同時在培養基中加入抗菌劑、抑菌劑等物質，簡化了植物組織培養工作，而且提高了組培苗的成活率和生長發育速度[2，4]。

②光源上的研究新進展 光是影響植物生長的重要因素之一。近年來，在光源方面出現了諸多報道，其中關于LED燈的研究最為火熱。LED燈具有體積小、耗電量低、壽命長、高亮度、低熱量等優點，因而被人們應用于生產、生活等方面，研究發現其在節能和促進植物生長方面也有明顯的優勢[5]。但LED燈含有多種有毒元素，廢舊的LED燈處理不當會危害環境，此外其發出的藍光和UV（紫外光）對人體具有一定危害。除LED燈之外，SILHOS和CCFL等新型光源也將是發展的主流。

③與其他技術相結合 a.與細胞融合技術相結合。植物體細胞雜交是將不同科、屬、種間的原生質體通過人工誘導融合再培養，創造出新的優良品種的技術[6]。利用甘薯品種間體細胞融合產生的新品種，為甘薯育種提供了新方法[7]。

b.與輻射技術相結合，篩選有利變異體。細胞在分裂過程中受外界如輻射等影響，往往會發生突變，產生變異，可從中篩選出有利變異體，應用于生產。20世紀末陸漱韻等[8]選用浙60-2、徐薯、栗子香3個品種進行輻射，初步獲得對線蟲性糠腐病抗擴展的變異系。

隨著人們對組培的多角度研究，多因子綜合控制技術逐漸被應用，該項技術有效降低了生產成本，使組培苗商品化成為可能[4]。

2 甘薯病毒病發生概況及種類介紹

2.1 甘薯病毒病發生概況

自1919年報道甘薯病毒病以來，世界各地相繼報道了甘薯病毒病的發生。我國甘薯種植面積大，甘薯病毒病發病率普遍較高，部分品種甚至達90%以上[9]。田間環境復雜，暴發的甘薯病毒病往往為復合侵染型，因此，有關甘薯病毒病的報道中對其名稱及癥狀的描述較為混亂。直到1974年以后，才有部分病毒被純化鑒定出來，但甘薯病毒病的許多病原至今仍不清楚，有關已分離出的幾種病毒分子的研究成果也不多。截至2011年，在甘薯中發現病毒近30種[10]；至2012年，我國甘薯上已確定至少存在8種病毒，但由于缺乏甘薯病毒種類鑒定系統，因而還有多種尚不確定[11]。

2.2 甘薯病毒病的種類介紹

2016年2月6日，我國學者張振臣在邯鄲市“第三屆中原脫毒甘薯產業發展研討會”上，對甘薯病毒病的識別及綜合防控技術進行了總結。他認為，目前世界上已公開的甘薯病毒有32種，我國有20種，其中發現并命名4個雙生病毒新種，6種甘薯病毒中國新紀錄種。我國甘薯病毒特點為種類多、新病毒多、一株甘薯上復合侵染現象嚴重，病毒復合越多，對甘薯的產量影響越大（表1）。目前，甘薯常見的4種主要病毒病及其為害情況見表2。

表1 復合侵染類型及其占比情況

3 甘薯組織培養技術在脫毒方面的應用

3.1 歷史概況

1960年Nielsen最先獲取甘薯脫毒苗，雖然甘薯脫毒苗培育技術起步晚，但發展迅速。莖尖分生組織培養技術的興起為病毒病的控制開辟了一條新途徑。我國自1985年開展甘薯脫毒研究以來，在甘薯脫毒苗的研究上取得了顯著成果。該項技術在我國甘薯栽培史上產生了革命性的影響，成為我國繼馬鈴薯脫毒苗之后生物技術應用于生產的又一典范[9]。

表2 甘薯上發生的4種主要病毒病及其為害情況

3.2 方法研究進展

①脫毒原理 通過對植物細胞的研究發現，一方面植物莖尖分生組織中沒有維管束系統，病毒在該區域運動困難；另一方面病毒的繁殖必須依賴寄主細胞的代謝過程，但無法與植物分生組織旺盛的代謝活動相競爭。因此，分生區高濃度的生長素可能會影響病毒的繁殖[12，13]。因而，對莖尖無毒區進行離體培養，理論上可得到無毒苗。

②脫毒技術 獲取無毒或少毒的甘薯莖尖一般采用層剝法，即以在無菌環境下剝取0.2～0.4 mm、并帶1～2個葉原基的莖尖為材料。近年研究發現，剝離到還剩5～6層時采用“一刀切”的快速剝離技術，成活率、成苗率比常規技術分別提高219.2%和429.7%[14]。

③熱脫毒技術與莖尖培養相結合 高溫可鈍化病毒，抑制病毒生長，降低病毒移動速度，將熱處理與莖尖培養技術相結合，可利用高溫對病毒的不利影響降低莖尖分生區病毒含量，提高脫毒苗培育的成功性。梁艷榮等[15]研究證明，通過2種技術的結合可以消除常見的馬鈴薯S病毒 （PVS）和馬鈴薯X病毒（PVX），為甘薯病毒病脫毒技術的應用提供了參考。

3.3 病毒檢測技術

甘薯莖尖分生組織培養得到的植株并不都是脫毒苗，只有經過檢測，才能投入使用。迄今為止，檢測方法主要有以下4種：目測法、指示植物法、酶聯免疫吸附法、分子生物學檢測技術。

①目測法 即用人的肉眼觀察判斷。該方法主要根據甘薯葉片和塊根上表現出的典型癥狀判斷甘薯是否攜帶病毒。但田間的甘薯病毒往往復合侵染，有些甘薯本身具有耐毒性，因此該方法精確度不高。

②指示植物法 將疑似帶病苗與其他植物嫁接，觀察嫁接后的植株上是否產生枯斑，在一定范圍內，枯斑個數與侵染性病毒的濃度成正比，因此可用枯斑數作為檢測病毒有無或多少的依據[15]。在甘薯研究中常用巴西牽牛為指示植物，經過近幾年的試驗發現，甘薯、巴西牽牛試管苗嫁接法可以替代傳統的巴西牽牛種子苗網室嫁接法檢測甘薯組培苗是否帶有病毒，新方法操作簡單、靈敏度高、成本低、打破季節和環境的局限[16]。但由于組織培養受無菌環境的約束，該方法不能推廣到田間進行。

③酶聯免疫法 提取樣品溶液，自然干燥后按國際馬鈴薯中心提供的酶聯包說明書進行陽性對照。通過對比葉片、葉柄的研究結果，葉柄因含有較少雜質、局限性小而具有較高陽性檢出率[17]。但該方法存在假陽性或假陰性的可能，在應用上存在一定局限。

④分子生物學檢測法 分子生物學方法可分為3種，研究中最常用的為RT-PCR檢測技術，利用cRNA探針，通過雜交、擴增目的片段的方法檢測病毒的存在。近年來，隨著檢測樣品不斷增多，每次只能檢測一種病毒，因而該技術已遠遠不能滿足學者們的研究需求，雙重RT-PCR檢測技術和多重RT-PCR檢測技術的出現極大地提高了病毒檢測效率[18]。相較于前幾種方法，分子生物學方法檢測靈敏度高，具有更加廣闊的應用前景。

3.4 脫毒技術與組織培養技術的對比

試管苗組織培養技術又叫微型繁殖技術，主要利用植物離體的細胞、器官、組織等材料培育形成新植株，廣泛應用于種質資源保護、果樹生產、珍稀植物擴大生產、作物脫毒等方面，如北京華楸微型繁殖技術可在短時間內生產大量優質苗木，補充市場需求[19]。莖尖分生組織培養技術是最常用的脫毒技術，可以說脫毒技術是試管苗組織培育技術應用的一個重要方向，同時又是對試管苗組織培育技術的一個深入發展。從研究時長講，甘薯脫毒技術研究時間比甘薯試管苗組培技術早，直至莖尖分生組織無病或少病被發現，才將兩者真正有機結合在一起；從整體來看，有關試管苗組培技術的報道比脫毒技術多，技術上也相對成熟一些；從研究深度講，脫毒技術的研究進展多停留在對MS培養基的改進以及莖尖無毒組織的提取，而對與其他技術結合（如基因工程）的報道較少，研究深度不如試管苗組織培養技術廣。

4 甘薯脫毒技術現存問題及研究展望

培育甘薯脫毒苗可有效消除植物病毒，從而獲得不帶病毒植株，同時脫毒苗又具有葉面積大、葉綠素多、光合作用強等優勢，可使農作物產量增加，品質得到改善。因此，對脫毒技術的深入研究是提高甘薯抗病性、質量、產量的一個重要方法。

目前，隨著研究的推進及長期觀察發現，甘薯脫毒技術仍存在較多未解決的問題：①病毒變異性強。隨著土質、氣候的變化及人為或入侵物種的干擾，新的病毒不斷產生。②成功的愈傷組織誘導培養條件存在差異，且不適合復制。例如脫毒甘薯一號最佳培養條件為1/2MS+無支持物+LED燈+30 g/L綿白糖+自來水[20]，而煙薯25最適培養基為MS+0.05 mg/L GA+0.04 mg/L IBA[14]。③脫毒苗投入生產不久又會重新感染病毒，脫毒持續時間較短等。

因此，今后需要建立一套完整的病毒防控系統，關鍵是從探究病原開始對癥下藥，一方面做好對已知病毒的控制，研究建立更具普遍性的脫毒技術；另一方面通過對現有病毒的分析，做好預防工作。同時，應在深入研究脫毒技術的同時探索與其他生物技術的結合，取其精華剔除糟粕，探索真正適合甘薯生產的相關技術并推廣至生產應用。

目前，甘薯病毒病發生嚴重，且有蔓延惡化趨勢，不但影響了甘薯產量，阻礙了甘薯產業發展，而且不利于甘薯種質資源的保存。因此，加強對甘薯病毒病脫毒技術的基礎理論和應用技術研究，不僅有望保護甘薯種質資源的物種多樣性，促進甘薯產業的健康發展，也為今后甘薯脫毒技術的發展乃至其他生物脫毒技術的研究提供強大的支持，由此可見，甘薯病毒病脫毒技術的研究仍任重而道遠。

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