氨基酸對豬手工克隆重構胚胎發育效果的影響

呂玲燕 陳寶劍 吳永紹 孫如玉 汪燕玲 馬青艷 潘天彪

摘要：為了探討氨基酸對豬手工克隆（HMC）重構胚發育效果的影響，比較了必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）對卵母細胞的成熟狀況以及對豬HMC重構胚胎發育潛能的影響。結果表明，成熟培養液中添加EAA、NEAA及EAA+NEAA之間的成熟率差異不顯著，但均顯著高于空白對照組（P<0.05）；胚胎培養液中添加EAA、NEAA及空白對照組的卵裂率都顯著高于EAA+NEAA（P<0.05）；囊胚率及細胞總數，NEAA組顯著高于空白對照組及EAA+NEAA組、EAA組（P<0.05）。

關鍵詞：氨基酸；豬；重構胚胎；發育效果

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）06-0108-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.027

Abstract： Effect of developmental potency of reconstructed embryos on pig handmade clone（HMC） of amino acid was investigated. In this study，we compared with the effect of the essential amino acid（EAA） and the essential amino acid （NEAA） on oocyte maturation rate and porcine HMC reconstructed embryos developmental potency. The results showed that the difference of maturation rate was not significant between the group of EAA，NEAA and EAA+NEAA in maturation medium，yet was significantly higher than the control group（P<0.05）；the cleavage rate of EAA group， NEAA group and the control group was significantly higher than EAA+NEAA group in embryo culture medium（P<0.05），as for the blastocyst rate and the total number of cells，the group of NEAA was significantly higher than the group of control， EAA+NEAA，EAA（P<0.05）.

Key words： amino acid；porcine；reconstructed embryos；developmental potency

隨著豬胚胎工程的發展，可以改良品種、培育抗病豬種、提高肉質、生產轉基因豬或基因組修飾豬、制備人類疾病模型、進行器官移植、生產藥物蛋白、研究發育機理等[1]。胚胎的體外培養是豬胚胎工程的主要環節之一，無論是體外受精（IVF）、核移植技術還是基因敲除，所生產的胚胎都要經過體外培養，發育到適當的階段才能進行后續的研究。影響豬胚胎體外發育的因素有很多，比如滲透壓大小[2]、氧化應激反應[2]、螯合劑[3]、能量基質、氨基酸[4]等。而其中卵母細胞體外培養的成熟情況又是至關重要的，直接影響到后期胚胎的發育。有關氨基酸對豬卵母細胞的體外成熟及早期胚胎體外發育效果影響的報道鮮見，本試驗探討不同氨基酸濃度對豬卵母細胞體外成熟效率以及對手工克隆重構胚胎發育效果的影響，從而優化豬HMC的技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清（FBS）、TCM-199粉劑、DMEM粉劑購置于美國Gbico公司，激素eCG、hCG購置于美國Sigma公司，其他化學試劑如無特殊說明均購置于美國Sigma公司。

1.1.2 儀器 細胞融合儀型號：ECM2001、融合槽型號：BTX 450、胚胎積聚針型號：DN-10式、卵母細胞成熟培養皿：35 mm及60 mm 塑料平皿、去核切割刀自制、胚胎培養皿：四孔板。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的成熟培養 取卵巢表面2～6 mm的卵泡，于試管中靜置，棄去上清，留沉淀部分分裝。挑選含有3層及以上有顆粒/卵丘細胞包被、折光性良好的卵丘卵母細胞復合體（COCs），放入成熟液中（含10 IU/mL hCG+10 IU/mL eCG）培養，將卵母細胞隨機分成4組：①空白對照組；②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同時添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA），20～22 h后換成不含激素的培養液，繼續培養18～20 h至細胞成熟。

1.2.2 供體細胞的處理 分離出胎豬大腿組織，將其剪碎至2～3 mm的組織塊，加入少量含10% FBS的DMEM培養液，均勻鋪開，在皿蓋做好標記，將其倒扣于培養箱中，4 h后加入少量培養液，防止組織塊漂浮。24 h后在平皿底部加滿培養液，48 h后繼續觀察成纖維細胞的生長狀況，待成纖維細胞生長至90%左右匯合度時，進行傳代培養，用作豬手工克隆供體細胞。

1.2.3 重構胚的構建、培養以及囊胚細胞計數 將帶核的卵母細胞置于含2.5 μg/mL CB的切割液中去核，等其恢復成圓形后，與已處理好的供體細胞進行黏合，形成卵-供體-卵式的黏合體（形成三角狀），移入電融合液中進行一步融合，參數為AC：6 V/cm；DC：1.2 kV/cm，30 μs，2 DC，電激活后放入培養箱中恢復30 min，然后檢查其融合/激活情況。將融合后的重構胚放入PZM-3中激活，其含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX，每滴激活液中放入1枚重構胚，激活4 h。胚胎培養隨機分成4組：①空白對照組； ②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同時添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA）。48 h觀察卵裂率，160～168 h觀察囊胚率。在培養后6～7 d收集囊胚，置于Hoechst 33342染液中，石蠟-凡士林封片，熒光顯微鏡下觀察記錄囊胚細胞總數目。

1.3 統計分析

所得數據由SPSS17.0軟件進行統計分析，試驗每重復1次均為同1批次試驗，使用相同來源的卵巢和試驗條件，所有試驗至少重復4次。

2 結果與分析

2.1 EAA、NEAA及EAA+NEAA對卵母細胞成熟效率的影響

卵母細胞的成熟培養液中添加EAA及NEAA，濃度分別為2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培養40～44 h。試驗結果表明，添加2%EAA組、1%NEAA組及2%EAA+1%NEAA組之間的差異不顯著，但均顯著高于空白對照組，結果見表1及圖1。

2.2 EAA、NEAA及EAA+NEAA對重構胚發育效果的影響

胚胎培養液中添加EAA及NEAA，濃度分別為2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培養160～168 h。試驗結果表明，添加2%EAA組、1%NEAA組及空白對照組的卵裂率顯著高于2%EAA+1%NEAA組（P<0.05）；就囊胚率及細胞總數而言，1%NEAA組顯著高于空白對照組及2%EAA+1%NEAA組、1%EAA組（P<0.05），結果見表2及圖2。

3 討論

氨基酸的主要生理作用主要包括合成蛋白質和核苷酸、提供營養和能量、調節滲透壓，抗氧化、調節pH、信號轉導分子的生物合成，以及參與滋養外胚層分化和內外胚層之間基膜形成[6]。雖然對氨基酸代謝機制的研究取得了一定的進展，但其確切的作用機理尚不明了，添加氨基酸是否對豬卵母細胞、胚胎的體外培養有利一直存在爭議[5，7-9]。

就氨基酸對卵母細胞的成熟作用而言，侯文文[8]研究表明，不同濃度必需氨基酸和非必需氨基酸添加到豬卵母細胞體外成熟培養液中，發現在成熟率上，試驗組與對照組都沒有顯著差異（P>0.05）。馬紅等[9]研究表明在卵母細胞的成熟培養液中添加1%EAA、1%NEAA及1%EAA+1%NEAA均能提高卵母細胞在體外的成熟率，且都顯著高于空白對照組（P<0.05），本試驗的研究成果與馬紅等[9]得出的結論相一致。

就氨基酸對胚胎體外發育效果作用而言，信吉閣等[10]研究表明在胚胎培養液中添加氨基酸能提高豬孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細胞總數，且明顯高于空白對照組。鄭云勝等[11]研究表明，綿羊胚胎體外培養時，NEAA和EAA具有互補性，NEAA促進囊胚以前的發育，EAA促進囊胚以后的發育。成俊萍等[12]研究表明，NEAA可顯著提高水牛卵母細胞IVF后胚胎的分裂率，但對囊胚發育率無顯著影響，低濃度的EAA對水牛IVF胚胎的發育具有一定促進作用，但高濃度則有抑制作用。結果表明，成熟培養液中添加EAA、NEAA及空白對照組的卵裂率都顯著高于EAA+NEAA組（P<0.05），這可能是由于EAA和NEAA之間的相互作用，產生的某些化學物質降低了HMC重構胚發育的卵裂率；就囊胚率及細胞總數而言，NEAA組顯著高于空白對照組及EAA+NEAA組、EAA組（P<0.05），這與前人的研究結果基本保持一致。在胚胎發育的不同階段對氨基酸的需求量是不同的，EAA雖對早期分裂胚胎有抑制作用，但對8～16細胞之后的胚胎發育沒有任何不利影響，而NEAA在8～16細胞至囊胚階段，對哺乳動物胚胎發育也有促進作用[13]。另外必需氨基酸和非必需氨基酸種類很多，它們相互之間及其與培養液中其他成分的作用比較復雜，只有充分了解他們之間的相互作用，以及卵母細胞和胚胎各個發育時期對氨基酸的需求量，才能更有效地調整培養條件以期提高HMC重構胚胎的體外發育能力。

參考文獻：

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