濕熱環境對CCl4誘導大鼠肝炎模型的影響及代謝組學研究＊

王 洋，蔡志鋼，張永煜

（1.上海中醫藥大學中醫方證與系統生物學研究中心 上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203；3.麥特繪譜生物科技（上海）有限公司 上海 201203）

濕熱既是常見的致病因素，又是疾病過程中容易出現的特殊病理狀態，常使疾病纏綿難愈。濕熱證在一些疾病中分布突出，如肝炎[1]、關節炎[2]、原發性腎小球疾病[3]。隨著中醫癥候研究的深入，癥候動物模型的復制成為中醫癥候研究的瓶頸之一。濕熱證的規范化、標準化、客觀化的動物模型研究將為濕熱證的證物質內涵研究奠定了良好的基礎[4]。目前為止，濕熱證動物模型建立大都遵循模擬傳統病因“外濕引動內濕”的基本要求，一般采用“飲食+環境+致病因子”復合因素造模[5,6]。有研究對濕熱環境下正常飲食和高脂飲食的濕熱動物模型進行了比較，發現飲食對動物模型的影響無顯著差異性[7]，本課題組在前期研究中采用“高糖高脂飲食+濕熱環境+酒精”復合因素進行了模型篩選，根據臨床以及濕熱證動物模型篩選研究結果提示濕熱環境對濕熱模型的影響可能更突出。因此，本研究考察濕熱環境對四氯化碳致大鼠慢性肝炎疾病的影響作用。通過一般體征指標、生化指標、病理切片、代謝組學四個方面探討濕熱環境對疾病的影響作用，并分析濕熱環境對疾病影響的物質基礎及機制。

1 材料

1.1 動物

Wistar雄性大鼠24只，120-140 g，飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心（清潔級）。室內溫度20-25℃，相對濕度為55-65%。購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證編號：2015000524543。

1.2 試劑

N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，含1%TMCS，美國Sigma-Aldrich公司，批號：33148），甲氧胺鹽酸鹽（美國Sigma-Aldrich公司，批號：226904），十七酸（美國Sigma-Aldrich公司，批號：H3500），甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：80080418），四氯化碳（批號：10006480），水合氯醛（批號：30037517），氯仿（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

氣相色譜-質譜聯用儀（GC/MS，Agilent6890/5975B，Agilent科技有限公司），氣相毛細管色譜柱（DB-5 MS，Agilent科技有限公司），微型漩渦混合器（Vortex-Genie 2，美國 Scientific Industries，Inc），樣品濃縮儀（SBH 130D/3，英國Stuart公司），高速冷凍離心機（Centrifuge 5415R，德國Eppendorf公司），Milli-Q超純水系統（Milli-Q Gradient，Millipore中國有限公司），數控超聲儀（KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司），低溫冷凍冰箱（U9260-020，英國），人工氣候箱（上海三騰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組及造模

Wistar大鼠適應性飼養一周左右，體重達200 g左右后，進行隨機分組。動物分組：正常組、模型組一（單純CCl4，6周）、模型組二（CCl4+濕熱環境，6周）。模型組一和模型組二第一次以CCl4純溶液5ml/kg進行灌胃，隨后每周兩次以50%CCl4橄欖油溶液1ml·kg-1進行腹腔注射。模型組二第三周開始，每天放入人工氣候箱（溫度為32℃，濕度為90%）6小時，其他時間在室溫下飼養。所有組于第六周全部處死。

2.2 動物取材

將大鼠禁食不禁水12小時，收集動物各類生物樣本。

血清：10%水合氯醛將大鼠麻醉，劑量為0.3ml·100g-1。完全麻醉后，腹主動脈取血。血液靜置3 h后，于4℃離心機4000 rpm離心10 min，取150 μl血清于1.5 ml離心管中，隨后放于冷凍盒中，-80℃冰箱中保存。血清取兩份，一份用于生化指標檢測，一份供代謝組學檢測用。

肝臟：取血結束后，進行肝臟分離，并稱量肝重，然后取肝臟最大葉中間部分組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，進行HE染色和Masson染色；其余部分放入凍存管，投入液氮中，之后轉移至-80℃冰箱，供代謝組學檢測用。

2.3 一般體征檢測

每周對大鼠體重、飲食量、飲水量等進行兩次檢測，對毛色、糞便等進行觀察。

2.4 生化指標檢測

取150 μl大鼠血清，采用生化自動分析儀對血清進行TP、ALB、GLO、TBIL、ALP、GGT、TBA，采用南京建成生物工程研究所試劑盒按照說明書操作步驟對血清AST、ALT、SOD、MDA 及肝臟 Hyp進行檢測。

2.5 代謝組學檢測

2.5.1 血清衍生化處理方法及GC/MS檢測條件[8]

取100 μl大鼠血清于1.5 ml離心管中，加入內標十七酸甲醇溶液（1mg·ml-1）10 μl（沿內壁加入，不接觸血清）。加入300 μl甲醇、氯仿混合提取液（兩者體積比為3:1），渦旋振蕩30 s，放入-20℃冰箱中10 min進行蛋白沉淀。隨后進行10000 rpm離心10 min，吸取上清液300 μl于GC/MS進樣瓶，30℃下用氮氣進行吹干。加入甲氧胺吡啶溶液（15 mg·ml-1）80 μl，封蓋。渦旋振蕩30 s，在30℃的搖床中以250 rpm的頻率振蕩反應90 min，進行羰基反應。反應結束后，加入80 μl BSTFA（含1%TMCS），封蓋振蕩30 s，放入70℃烘箱中進行反應，60 min后取出后振蕩10 s。待GC/MS進樣。

質譜參數：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，AUX溫度260℃，高純氦氣流速1.0 ml·min-1，前進樣口溫度270℃，離子源電壓為70 ev，溶劑延遲5 min。質譜全掃描荷質比掃描范圍（m/z）為30-600。升溫程序如下：80℃保持2 min，隨后以10℃·min-1速度升高到120℃保持4 min，以10℃·min-1速度升高到180℃，隨后以5℃·min-1速度升高到195℃保持3 min，以5℃·min-1速度升高到240℃保持3 min，以30℃·min-1速度升高到300℃保持7 min。最后以300℃再保持2 min。

2.5.2 肝臟衍生化處理方法及GC/MS檢測條件[9]

將冷凍的肝組織在冰浴中稱取50 mg于1.5 ml離心管中，加入3倍量的生理鹽水，用均漿機研磨成漿。加入提取劑甲醇500 μl，渦旋1 min，放入-20℃冰箱放置10 min。取上清 200 μl于GC/MS進樣瓶中，30℃下氮氣吹干。加80μl甲氧胺吡啶溶液（15mg·ml-1），封蓋。渦旋30 s。30℃搖床反應90 min。加入80 μlBSTFA（含1%TMCS），封蓋振蕩30 s。70℃烘箱中反應60 min，取出振10 s，待GC/MS進樣。

質譜參數：離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，AUX溫度260℃，高純氦氣流速1.0 mL·min-1，前進樣口溫度270℃，離子源電壓為70 ev，溶劑延遲5 min。質譜全掃描荷質比掃描范圍（m/z）為30-600。氣相色譜升溫程序如下：80℃保持2 min，隨后以10℃/min速度升高到120℃保持4 min，以10℃·min-1速度升高到180℃，隨后以5℃·min-1速度升高到195℃保持3 min，以5℃·min-1速度升高到240℃保持3min，最后以12.5℃·min-1速度升高到290℃保持15 min。最后升高到300℃保持2 min。

2.6 數據處理

生化指標等統計采用mean±SD，T-test法進行統計分析。用GC/MS工作站及R軟件對代謝組學數據進行處理，采用多維統計及單維統計分析相結合的方法對差異代謝物進行分析與鑒定，最終將同時滿足VIP＞1.0、單維統計p＜0.05的代謝物鑒定為最終差異代謝物，并通過 KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）數據庫聯合HMDB（http://www.hmdb.ca/metabolites/）檢索各種差異代謝物及其KEGG化合物號，通過KEGG Mapper（http://www.genome.jp/kegg/mapper.html）和 MBRole（Metabolites Biological Role，http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/index.jsp）數據庫進行代謝通路分析，選擇p＜0.05的代謝通路進行深入分析。

3 實驗結果

3.1 一般體征變化

大鼠造模開始，每周稱兩次體重，飲食量，飲水量，此處將按每周一個時間點呈現體重變化趨勢，見表1及圖1。由圖表看出，造模開始，純四氯化碳灌胃急劇減輕大鼠體重，隨后模型組一和模型組二的大鼠體重增長明顯比正常組緩慢。模型組二比模型組一的大鼠體重增長更加緩慢。說明濕熱環境對大鼠體重增長具有抑制作用。根據不同組別的飲食量和飲水量的比較，發現飲水量在各組之間變化趨勢不明顯。而飲食量中，正常組每日飼料攝入量最多，其次是模型組一，最少組為模型組二，說明濕熱環境可以抑制大鼠飼料攝入量。隨著濕熱環境下造模時間增長，模型組二出現毛色發黃、大便稀溏、倦怠等癥狀。

3.2 生化指標

取150 μl大鼠血清，采用自動生化儀對TP、ALB、GLO、TBIL、ALP、GGT、TBA進行檢測。血清中ALT、AST、MDA、SOD以及肝臟Hyp指標則采用試劑盒進行檢測。如表2。由結果可以看出ALT、AST、GLO、TBA、TBIL、Hyp共6個生化指標在模型組與正常組中均存在統計學差異，且模型組二比模型組一變化差異更大。TP、SOD、GGT三個生化指標在模型組一與正常組之間無統計學差異，但是在模型組二中存在統計學差異。因此，通過生化指標結果提示濕熱環境可以加重疾病的嚴重程度，圖2。

表1 不同時間點三組大鼠體重表

圖1 不同組別大鼠體重隨時間變化趨勢圖

表2 各組血清生化指標統計表

圖2 不同組別大鼠血清生化指標柱狀圖

圖3 不同組別肝組織HE染色（×100）

3.3 組織病理觀察

肝組織HE染色結果顯示（圖3）：正常組肝臟結構正常；中央靜脈旁肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞體積較大。模型組一中大部分肝細胞腫大，發生脂肪性病變且病變區域多、面積大，病變區域占30%左右，炎癥細胞浸潤。模型組二中出點膠原纖維與網狀纖維沉積形成纖維間隔，肝小葉結構紊亂，脂肪性病變區域達35-40%。

肝組織Masson染色結果顯示（圖4）：正常組結構完整，肝細胞索排列整齊；模型組一中出現大量脂肪變性以及膠原纖維，分析該組全部動物肝組織切片，大部分出現少量膠原纖維度。模型組二中出現大量脂肪變性以及數量較多的膠原纖維，一般膠原纖維不完全分隔包饒肝小葉，嚴重者出現膠原纖維沉積和形成明顯的假小葉。說明濕熱環境加重疾病模型嚴重程度。

3.4 血清代謝組學結果

圖4 不同組別肝組織Masson染色（×100）

圖5 模型組與正常組比較得分圖

通過PCA圖就可以看出正常組與模型組二分別出現不同區域的聚集，提示兩組之間存在一定差異，PLS-DA分析顯示這種差異更加清晰明顯（圖5）。為了獲得濕熱環境對模型影響的代謝物質基礎，將模型組二與正常組比較，進行OPLS分析，篩選符合VIP＞1.0并且p＜0.05條件的差異變量，最終定性分析獲得17個差異峰，結果見表3。

3.5 肝臟代謝組學結果

模型組二和正常組的肝臟代謝輪廓之間PCA分析結果可以看出在不同的區域聚集，說明兩組在肝臟部位代謝物差異明顯（圖6A）。PLS-DA得分圖顯示差異性更明顯（圖6B）。通過多維統計和單維統計，選擇VIP＞1并且單維統計p＜0.05的差異變量，對差異變量進行鑒定核對，代謝差異物結果見表4。

3.7 血清、肝臟代謝通路分析

將血清、肝臟中篩選出的代謝差異物用MBRole數據庫進行富集分析，計算出p小于0.05的差異性通路。如表5。可以看出血清、肝臟中存在4條共同的代謝通路，同時又具有各自特異的代謝通路。血清中有4條特異代謝通路，分別為Butanoate metabolism、Glycine,serine and threonine metabolism、Lysine degradation、Primary bile acid biosynthesis。肝臟中也有4條特異代謝通路，Arginine and proline metabolism、Biosynthesis of unsa-

表3 正常組與模型組二之間血清差異性代謝物列表

圖6 各模型得分圖及模型參數

表4 正常組與模型組二之間肝臟差異性代謝物列表

4 討論

4.1 濕熱環境與疾病體征、生化指標

本研究發現正常環境下模型組比正常組大鼠體重明顯減輕，其原因為四氯化碳造成，但是在濕熱環境下，與正常組相比體重減輕更加明顯，同時其飲食量也存在這種變化趨勢，即食欲不振。此外，濕熱組模型大鼠出現大便稀溏、體毛發黃，肛溫升高等體征，與臨床濕熱表現相似。劉曉鷹等[10]進行IgA腎病濕熱證模型復制時，模型組大鼠出現了聳毛、食欲不振、大便稀溏等現象。復制脾胃濕熱證大鼠模型過程中發現溫病濕熱證動物會出現肛溫升高、體重減輕、飲食減少、活動減少、大便黏滯等癥狀，在慢性胃炎大鼠濕熱證中，也發現正常組體重高于單純胃炎組體重，單純胃炎組高于脾胃濕熱組[11]。本研究結果與文獻報道相一致。說明了濕熱環境因素抑制了大鼠體重的增長，并導致類似臨床濕熱癥狀的出現。

血清中ALT、AST含量高低是肝細胞損害程度指標之一。兩項指標在濕熱環境下模型組中比正常環境下模型組變化更明顯，提示濕熱環境加重肝細胞損傷。臨床研究發現慢性乙型肝炎肝膽濕熱證與ALT、AST、GLO、TBIL、GGT等生化指標存在直線正向相關關系[12-14]。研究中正常環境下模型ALT、AST、GLO、TBA、TBIL、ALP與正常組相比具有統計學差異，而濕熱環境下這些生化指標的差異性進一步增大，同時，TP、SOD、GGT三個指標也出現了統計學差異。說明濕熱環境會使疾病的嚴重程度加重，與臨床研究相似。從組織病理切片（HE染色，Masson染色）結果中可以進一步濕熱環境會加速疾病的進展以及加重疾病嚴重程度。

4.2 濕熱環境影響疾病進展的物質基礎

通過生化指標、病理組織結果可以得出模型組二比模型組一疾病狀態更嚴重，說明濕熱環境加重疾病嚴重程度。為尋找疾病嚴重程度與體內代謝物質水平之間的關聯，通過代謝組學PCA和PLS-DA模型分析分別在血清、肝臟中找到17、34種差異代謝物，大部分代謝物在濕熱環境中比正常環境水平變化更明顯，如血清中Mannose、Cholesterol、Oxaloacetate、Glutarate；肝臟中變化明顯脂肪酸如Stearic acid，Hexadecanoic acid。對差異代謝物進行通路分析，發現ABC transporters、Alanineaspartateglutamate metabolism、Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Galactose metabolism在血清、肝臟中均發生了變化。在血清、肝臟中還發現各自特有代謝通路，其中血清中有4條，肝臟包含4條。將代謝通路進行歸類分析，血清中代謝通路主要為氨基酸代謝，肝臟中主要為脂質代謝、氨基酸代謝為主，如圖7。血清、肝臟中均發現脂質代謝存在異常，血脂異常則會促使一些炎癥因子分泌，如IL-6、TNF-α等表達增加，進而啟動了一系列物質表達和信號傳遞異常[15]。藥物肝毒性會引起肝細胞內長鏈脂肪酸代謝發生紊亂，尤其是脂肪酸的氧化過程，脂類化合物水平會發生顯著變化[16]，這些改變意味著肝損傷大鼠體內氨基酸代謝、脂代謝、膽汁酸代謝以及體內氧化-抗氧化作用失衡[17]。濕熱環境則進一步加重了這些代謝水平紊亂導致加深疾病嚴重程度。

表5 血清、肝臟差異性通路列表

圖7 血清、肝臟代謝通路分析

1 毛果.基于回顧性流行病學調查的1868例慢性乙型肝炎患者中醫 證候分布特征研究.湖南:湖南中醫藥大學碩士學位論文,2015.

2 牛潔.膝骨性關節炎濕熱證分布規律及診斷標準探討.北京:中國中醫科學院碩士學位論文,2006.

3 李小會,謝桂權.290例原發性腎病綜合征中醫證型分布及與感染的相關性研究.遼寧中醫雜志,2011(4):616-618.

4 廖榮鑫,吳仕九,文小敏.濕熱證的現代研究及進展探討.遼寧中醫雜志,2005,32(10):1007-1008.

5 王瑾,陳宜鴻,趙志玲.中醫溫病濕熱證動物模型實驗的研究.解放軍藥學學報,2002,(04):209-211.

6 馮雪梅.溫病濕熱證證候規范化研究.廣東:廣州中醫藥大學博士學位論文,2007.

7 程方平,李家庚,劉松林,等.濕熱證大鼠模型的研制與評價.中華中醫藥學刊,2007,12:2549-2551.

8 戴建業.整體代謝視角下黃芩柴胡藥對對于兩種疾病濕熱證的藥效評價及機制研究.上海:上海中醫藥大學博士學位論文,2014.

9 孫淑軍.補虛化瘀方治療原發性膽汁性肝硬化的藥效機制研究.上海:上海中醫藥大學博士學位論文,2015.

10劉曉鷹,杜恒,王文廣,等.IgA腎病濕熱證模型的研制.中華中醫藥學刊,2008,9:1947-1949.

11趙藝.慢性胃炎大鼠脾胃虛證和濕熱證證候模型的造模方法.中國中西醫結合消化雜志,2014,(4):221-223.

12李亞萍.慢性乙型肝炎肝膽濕熱證規范化診療方案的研究.山東:山東中醫藥大學博士學位論文,2012.

13李梢,張寧波,李志紅,等.慢性乙型肝炎患者肝膽濕熱證和肝郁脾虛證的決策樹診斷模型初探.中國中西醫結合雜志,2009,(11):993-996.

14李妮矯,王君,姚樹坤.濕熱證與肝臟炎癥指標的相關性研究.中國中醫基礎醫學雜志,2011,(3):294-295.

15劉子志,尚文璠,常東.舒膽膠囊干預肝膽濕熱證療效觀察及對血脂和炎癥因子表達的影響.新中醫,2014,(9):54-56.

16劉曉燕,劉艷秋,程孟春,等.超高效液相色譜-質譜聯用技術在藥物肝損傷代謝組學研究中的應用.色譜,2015,(7):683-690.

17楊麗娜,溫靜,孫毅,等.四逆散抗肝損傷作用的大鼠血清UPLC-MS/MS代謝組學研究.藥學學報,2014,(3):368-373.