極干旱區大氣PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷研究

圖爾貢·艾爾肯，迪麗努爾·塔力甫*，邵龍義，買麗克扎提·買合木提，亞力昆江·吐爾遜，阿布力克木·阿布力孜

1. 新疆大學//煤炭清潔轉化與化工過程自治區重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046；2. 中國礦業大學資源與地球科學系//煤炭資源與安全開采國家重點實驗室，北京 100083

PM2.5為空氣動力學當量直徑小于2.5 μm的顆粒物質，又稱為可吸入肺顆粒物。近幾年，隨著經濟的迅速發展，大氣污染嚴重并且污染范圍日益擴大。大氣顆粒物會對人體健康（郭新彪等，2013；王文朋等，2015；張小曳等，2013）、能見度（邵龍義等，2000）和氣候（殷永文等，2011）產生影響，因而顆粒物污染引發的健康問題受到公眾的廣泛關注（Costa et al.，1997；白志鵬等，2006；郭辰等，2014；游燕等，2012；周林等，2009）。當PM2.5濃度增高時，心肺疾病的發病率、死亡率也增加，主要出現在患有呼吸、心血管系統疾病的人群及身體狀況不佳的老年人中（Costa et al.，1997）。目前為止，人們對 PM2.5的致病機制仍不清楚，顆粒物氧化性損傷假說是目前被廣泛接受的觀點（Shao et al.，2007；Greenwell et al.，2003），即顆粒物表面的生物可利用的過渡金屬離子所產生的自由基（?OH）是顆粒物能夠產生氧化性損傷的原因（Costa et al.，1997）。胡穎等（2013）使用質粒DNA評價法對北京市大氣顆粒物對DNA的損傷的研究表明，北京市大氣顆粒物全樣的氧化性損傷等于或略大于相應的水溶部分，生物活性隨劑量的增加而降低；蓉蓉等（2013）對澳門可吸入顆粒物的氧化性損傷研究表明，澳門中山公園可吸入顆粒物的氧化性損傷能力表現為冬季和夏季基本相同，同一季節不同采樣點氧化性損傷能力不同；肖正輝等（2009）對蘭州市大氣PM10對質粒DNA的損傷研究表明，蘭州市大氣PM10對質粒DNA的氧化性損傷具有冬、夏季相對較強，春、秋相對較弱的特征；蘇都爾·克熱木拉等（2014）對烏魯木齊大氣 PM2.5對質粒DNA的損傷研究表明，烏魯木齊大氣PM2.5對質粒DNA的損傷具有全樣TD30（大氣PM2.5對質粒DNA造成的破壞達到30%時所需要的顆粒物劑量水平）值與平均溫度呈顯著正相關，水溶部分的TD30值與風速呈顯著正相關，與相對濕度呈顯著負相關的特征。目前，對全年降水稀少、風沙較多的和田市城區大氣PM2.5對質粒DNA氧化性損傷能力、沙塵與非沙塵天氣的生物活性的差異、不同風速對生物活性的差異的研究未見報道，故本研究圍繞以上內容開展。

和田市南鄰昆侖山，西抵喀拉昆侖山和帕米爾高原，東北為浩瀚的塔克拉瑪干沙漠，是中國5大沙塵暴多發區之一。年均降水量35 mm，年均蒸發量高達2480 mm，大風天氣較多，沙塵暴發生頻繁，屬干旱荒漠性氣候，每年浮塵天氣達220 d以上，其中濃浮塵（沙塵暴）天氣在60 d左右。因此，利用質粒DNA評價法檢測和田城區大氣PM2.5對質粒DNA造成的破壞達到 30%時所需要的顆粒物劑量水平（TD30），有利于揭示極干旱區域PM2.5中活性氧對人體健康的影響，同時也可為和田城區大氣污染控制工作提供理論依據。

表1 PM2.5樣品采集信息Table1 Sample information of airborne PM2.5 collected in Hotan city

1 材料與方法

1.1 材料

高壓滅菌的 HPLC級水，TBE緩沖液（sigmaUSA），X174-RF DNA（Promega USA），溴酚藍染色劑，溴化乙錠（劇毒），瓊脂糖（agarose）。采樣器為武漢市天虹儀表有限責任公司生產的智能大容量懸浮微粒采樣器（TH—1000），采樣流量為1.05 m3?min-1，采樣膜材料為石英微纖維濾膜（英國Whatman公司）。

1.2 樣品的采集

采樣點設在和田市環境保護局（東經77°30′～84°30′，北緯 34°～38°）4 樓樓頂，距地面 12 m，采樣點距和田市主干道500 m，附近沒有高層和污染源，能夠代表典型城區的空氣質量狀況。分別于2014年1月、4月、7月和10—11月進行采樣，每次采樣連續22 h。

用鋁箔紙將采集了 PM2.5樣品的石英微纖維濾膜包好后置于馬弗爐，經450 ℃高溫灼燒5 h，恒溫、恒濕48 h（溫度20±2 ℃，相對濕度45%～55%）后，用AB204-S型分析天平（梅特勒-托利多公司）稱量濾膜直至恒重，記錄濾膜總質量。所有采集到的樣品均置于冷凍柜-18 ℃中保存，以待實驗分析。具體采樣信息如表1所示。

1.3 質粒DNA損傷評價實驗

DNA評價法是一種定量評價PM2.5中活性氧對質粒DNA的氧化性損傷能力的體外方法（胡穎等，2013；蘇都爾·克熱木拉等，2014；郭茜等，2016），其基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基對超螺旋DNA產生氧化性損傷，最初的損傷表現為超螺旋DNA松弛，進一步損傷表現為DNA線化。這種損傷變化引起DNA在電泳儀中產生電泳淌度的變化，利用這一原理可將不同形態的DNA在瓊脂糖凝膠中分離開來，然后使用靈敏的顯像測密術測量線狀的和松弛狀的（被破壞的）DNA在所有DNA中所占的比例，可得出顆粒物對質粒DNA破壞的程度。凝膠制備是將2.5 g瓊脂糖和42 mL TBE緩沖液加入到500 mL錐形瓶中，然后加超純滅菌水至420 mL。將錐形瓶放入微波爐中加熱至溶液完全清澈后取出，待溶液冷卻至 78 ℃左右時，向錐形瓶中加入10 μL溴化乙錠，然后將錐形瓶中的溶液緩慢倒入放有2個梳子的凝膠淺槽中，直到凝膠完全凝固時輕輕將梳子移開。將凝膠放入電泳槽，向每個梳孔中注入20 μL樣品、?X174-RF DNA和染色劑三者的混合物，在30 V電壓下通電16 h后，使用紫外凝膠成像系統對凝膠進行成像處理。具體實驗步驟參見文獻（蘇都爾·克熱木拉等，2014；郭茜等，2016）。

本研究對每個樣品進行全樣與水溶樣品的DNA損傷率比較，并按不同劑量水平進行分析，使用紫外凝膠成像系統對凝膠進行成像，使用Syngene Genetools軟件對凝膠中不同形態DNA的光密度進行定量分析和統計，從而得到不同劑量濃度顆粒物對DNA的損傷率。每組劑量水平的樣品均設置平行樣，以便對照檢驗實驗的準確性；另外，為排除客觀因素的影響，每個樣品均設置1個不加樣品的空白濾膜對照，實驗結果取兩個平行樣品的平均值，再扣除空白對照的影響（Shao et al.，2016）。

圖1 和田城區不同風速PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值Fig.1 TD30 of whole sample and corresponding water- soluble fraction of PM2.5 collected from Hotan City in different wind speed

2 結果與討論

2.1 PM2.5質量濃度分析

風速是反映大氣動力穩定性的重要特征量，是與空氣污染密切相關的氣象參數，它對大氣污染物的稀釋擴散和三維輸送起著重要作用（劉宇等，2002）。從表 1可知，當風速小于或等于 5 km·h-1時，和田市城區PM2.5樣品的質量濃度日均值為626 μg·m-3；當風速為 5～10 km·h-1時，其質量濃度日均值為 1180 μg·m-3；當風速大于 10 km·h-1時，PM2.5質量濃度日均值達到 1254.48 μg·m-3。風速越大，PM2.5質量濃度越高，質量濃度與風速大體上呈正相關趨勢。楊書申等（2005）在研究風速對顆粒物濃度的影響時發現，風速越大，顆粒物濃度越低，即大氣顆粒物的質量濃度與日均風速呈負相關關系，這是因為風速越大，大氣污染物越容易稀釋擴散。然而，和田城區氣候比較干燥，風速越大，越容易導致揚沙和浮塵天氣，從而增加大氣顆粒物濃度。

2.2 PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷

2.2.1 同風速下PM2.5對DNA的氧化性損傷

由圖 1可知，同一采樣點在不同風速下不僅TD30值差異較大，而且全樣和水溶部分對質粒DNA的氧化性損傷也有所差異。不論是全樣還是水溶樣，其對質粒DNA的氧化性損傷均表現出隨風速減小而增大的變化特征。風速小于5 km·h-1時，PM2.5全樣和水溶部分 TD30的平均值分別為 4946 μg·mL-1和 6560 μg·mL-1，全樣的 TD30值小于水溶部分，可以觀測到的最低值分別為 444 μg·mL-1和481 μg·mL-1；當風速在 5～10 km·h-1時，全樣和水溶樣的 TD30值分別為 7839 μg·mL-1和 7771 μg·mL-1；當風速大于10 km·h-1時，全樣和水溶樣的TD30平均值分別為 11282 μg·mL-1和 11268 μg·mL-1。且當風速大于5 km·h-1時，全樣和水溶樣TD30的平均值相差不大。造成這種差異的原因可能是此風速段的樣品基本屬于冬季和采暖期樣品，此時田城區周邊的沙塵對 PM2.5的貢獻減少，但風速小，污染物長時間擴散不開，再加上燃煤、汽車尾氣等排放的大量燃煤飛灰和煙塵集合體長時間漂浮在大氣中（李鳳菊等，2008），吸附了大量的有毒有害物質，從而導致PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷較大。和田城區氣候常年干燥，風速較大時揚沙和浮塵天氣較多，地殼元素對 PM2.5的貢獻較大，使顆粒物的損傷能力降低。肖正輝等（2009）研究表明，2005年12月—2006年10月蘭州市區PM10全樣和水溶部分的 TD30平均值分別為 26 μg·mL-1和 126.5 μg·mL-1；沈蓉蓉等（2009）研究發現澳門地區冬季PM10的全樣和水溶部分的 TD30平均值分別為 11 μg·mL-1和 68 μg·mL-1；2013 年（全年）烏魯木齊市大氣 PM2.5全樣和水溶部分 TD30的平均值分別為487.25 μg·mL-1和 615.25 μg·mL-1（蘇都爾·克熱木拉等，2014）。以上研究結果均小于和田市城區風速小于5 km·h-1時TD30全樣和水溶部分的平均值。由此認為，和田市城區 PM2.5的全樣和水溶部分的氧化損傷能力均低于以上城市。

2.2.2 沙塵與非沙塵PM2.5對質粒DNA損傷的差異

圖2顯示了沙塵天氣和非沙塵天氣PM2.5的全樣和水溶部分的TD30值。在沙塵天氣，全樣和水溶部分的 TD30平均值分別為 9464 μg·mL-1和 8008 μg·mL-1，非沙塵天氣分別為 5949 μg·mL-1和 7822 μg·mL-1。表明沙塵天氣的全樣和水溶部分的 TD30值大于非沙塵天氣，即沙塵天氣期間 PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷相對較小。對北京春季沙塵暴期間采集的 PM10樣品進行分析，發現顆粒物的質量濃度高達1200 μg·m-3，仍未對DNA產生損傷（時宗波等，2004），肖正輝等（2009）對蘭州春季沙塵天氣的研究揭示，沙塵天氣 PM10的全樣和水溶部分沙塵顆粒物的氧化性損傷能力通常低于非沙塵顆粒。本研究結果與以上結論相一致。Shao et al.（2006）和 Sandstr?m et al.（2005）研究也進一步證實了沙塵顆粒物的氧化性損傷低于非沙塵顆粒。其原因是由于沙塵暴期間 PM2.5中的顆粒物以來自地表的較粗礦物顆粒為主，其表面吸附的水溶性微量元素含量相對較低。

圖2 沙塵與非沙塵PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值Fig.2 TD30 of whole sample and corresponding water soluble fraction of PM2.5 at dust and no-dust period in Hotan City

2.2.3 沙塵與非沙塵天氣

一般認為，大氣顆粒物樣品的肺部毒性來自于水溶組分（迪麗努爾·塔力甫等，2011），而Imrich et al.（2000）則指出，濃縮的大氣顆粒物中的不可溶部分可引起肺泡巨噬細胞的生物反應。由圖2可知，雖然非沙塵天氣7月20日、7月23日、4月8日樣品全樣的TD30值大于水溶部分的TD30值，但其他樣品水溶部分的TD30值大于全樣。這表明非沙塵天氣情況下，和田市城區全樣的毒性大于相應的水溶部分，即DNA的氧化性損傷可能主要來源于全樣。就沙塵暴天氣的樣品而言，除4月13日、10月29日采集的樣品其全樣的TD30值小于水溶樣的TD30值外，其余樣品的水溶部分的 TD30值均小于全樣的TD30值，這表明全樣的毒性小于相應的水溶部分，即DNA的氧化性損傷可能主要來源于水溶成分。該結論與郭茜等（2016）、胡穎等（2013）、沈蓉蓉等（2009）、蘇都爾·克熱木拉等（2014）、肖正輝等（2009）的結論相同。

2.2.4 TD30值與相應PM2.5質量濃度的相關性分析

可吸入肺顆粒物的質量濃度是目前空氣質量的主要標準之一。由圖3可知，當風速小于或等于5 km·h-1時，和田市城區 PM2.5質量濃度日均值為626 μg·m-3，全樣和水溶樣 TD30平均值分別為 4946 μg·mL-1和 6560 μg·mL-1；當風速介于 5～10 km·h-1時，和田城區 PM2.5質量濃度日均值為 1180 μg·m-3，全樣和水溶樣的TD30均值分別為7839 μg·mL-1和7771 μg·mL-1；當風速大于 10 km·h-1時，和田城區PM2.5質量濃度日均值達到 1254.48 μg·m-3，全樣和水溶樣的 TD30平均值分別為 11282 μg·mL-1和11268 μg·mL-1。在 0.05置信度水平下，全樣（r2=0.80）、水溶部分（r2=0.60）TD30的平均值與平均質量濃度之間有著明顯的正相關趨勢。烏魯木齊市TD30值與相應的PM2.5質量濃度的相關性分析證明，不論是全樣還是水溶部分的TD30，均與相應的質量濃度之間沒有相關性（蘇都爾·克熱木拉等，2014）。而和田城區PM2.5的質量濃度越高，其對質粒DNA的氧化性損傷就越小，這一結論與宋曉焱等（2010）得出的風速大的條件下單位質量濃度毒性較弱的結論相一致。

圖3 PM2.5的全樣和水溶部分的TD30值與相應質量濃度之間的相關性Fig.3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding mass concentrations

3 結論

（1）和田市城區不同風速條件下大氣 PM2.5的質量濃度有較大的差異，具有風速越大，PM2.5質量濃度越高的變化特征。

（2）不論是全樣還是水溶樣，其對質粒 DNA的氧化性損傷均表現出隨風速減小而增大的變化特征。

（3）沙塵期間PM2.5對DNA的氧化性損傷小于非沙塵天氣；沙塵期間PM2.5對DNA的氧化性損傷可能主要來自水溶部分。

（4）和田市城區PM2.5質量濃度與TD30值呈正相關趨勢，即 PM2.5質量濃度越高，其氧化性損傷越高。

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