肺腺癌上皮-間質轉化相關標識基因檢測的臨床意義

王烈 續力云 劉超武 陸暢暢 樂涵波

肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內肺癌死亡率居惡性腫瘤之首，5年生存率僅為10%～15%。其中，肺腺癌是絕大多數國家最常見的肺癌組織學亞型。侵犯周圍組織和轉移到遠處器官被認為是惡性腫瘤的特征，也是臨床腫瘤治療失敗的主要原因。最近研究表明，不管是侵襲還是轉移都依賴于癌細胞獲得上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力[1]，EMT的發現為研究腫瘤浸潤轉移機制及治療提供了新的方向和靶點。本研究通過檢測肺腺癌組織與癌旁組織EMT相關標識基因并進行對照研究，尋找肺腺癌EMT相關分子標志物，為評估肺腺癌預后的新指標及抗腫瘤轉移的新靶點提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2013年1月至2015年12月在本院接受手術治療的117例肺腺癌患者的資料和手術切除的肺組織標本，男41例，女76例；年齡42～75（52.4±9.8）歲；腫瘤最大徑 1.0～5.9（2.78±1.91）cm。納入標準：（1）所有患者均經術后病理確診；（2）術前未經放化療治療；（3）無明顯肝、腎功能損害；（4）術后臨床病理資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫塊大小、病理類型、轉移情況、分期；（5）排除惡性腫瘤史及其他部位原發腫瘤轉移病灶。病理分型參照2011年國際肺癌研究學會（IASLC）、美國胸科學會（ATS）和歐洲呼吸學會（ERS）公布的肺腺癌新分類標準，將肺腺癌分為：（1）原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）：局限性，腫瘤細胞沿肺泡壁呈鱗屑樣生長，無間質、血管或胸膜浸潤的小腺癌（≤3cm）；（2）微浸潤腺癌（minimally invasive adenocarcinoma，MIA）：孤立性、以鱗屑樣生長方式為主且浸潤灶≤0.5cm 的小腺癌（≤3cm）；（3）浸潤性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）：含有浸潤灶＞0.5cm，可被分為以鱗屑樣、腺泡樣、乳頭狀、實性生長方式為主的亞型，推薦新增“微乳頭狀生長方式”亞型。AIS和MIA通常劃分為非浸潤性腺癌。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌組織及癌旁組織RNA的抽提及逆轉錄取 100mg新鮮肺腺癌組織及癌旁組織加入1ml Trizol（Thermo Fisher Scientific，美國），勻漿器進行勻漿；采用試劑盒 RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975,Ambion,美國）提取石蠟組織總RNA。加入300μl氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min；13 000r離心15min，吸取上清液加入等體積異丙醇，混勻；13000r離心10min，棄上清液，加入700μl 75%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制乙醇；12 000r離心10min，棄上清液，干燥，加入20μl DEPC水溶解RNA。以上述RNA為模板進行反轉錄，冰上操作，按下述順序依次加樣：2.5μl RNA、1.5μl反轉錄引物、1μl RNA 酶抑制劑、2μl 10×Buffer、2μl 10nmol/L dNTP、1μl聚合酶，總體積為10μl，在旋渦混旋器上混勻 30s，12 000r離心 30s，放入ABI 7500實時熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems，美國）中，程序如下：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃冷卻。此反應產物置于-20℃備用。

1.2.2 引物的設計與合成 所有引物設計均來自NCBI、Primer designing tool，且所有引物設計均滿足以下條件：（1）引物長度為 17～25bp；（2）GC 含量 45%～55%；（3）熔鏈溫度 60℃左右；（4）A、C、G、T 堿基分布均勻。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本實驗以GAPDH為內參基因。GAPDH引物序列：上游引物 5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，下游引物 5′-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3′；鈣黏附蛋白 E（E-cadherin）引物序列：上游引物5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，下游引物5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′；波形蛋白（Vimentin）引物序列：上游引物5′-CGGGAGAAATTGCAGGAGGA-3′，下游引物5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′；Snail引物序列：上游引物5′-CAACCCACTCAGATGTCAA-3′，下游引物 5′-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3′；Slug引物序列：上游引物5′-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3′，下游引物5′-GGTAATGTGTGGGTCCGA-3′。

1.2.3 實時熒光定量PCR 每個樣品設3個復孔，擴增內參 GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Snail及 Slug，反應體系如下：5μl Taqman Universal Master MixⅡ（大連寶生物工程有限公司）、0.5μl引物、0.67μl反轉錄產物、3.83μl DEPC水，總體積為10μl。在旋渦混旋器上振蕩混勻5s，12 000r離心10s，放入ABI 7500實時熒光定量PCR儀，以下述條件進行PCR擴增：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個循環。每個樣本取3個重復孔Ct值的平均數，獲得各樣本組織ΔCt值（各目的基因Ct值-內參 Ct值），最終獲得各樣本 2-ΔΔCt值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織與癌旁組織 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA表達水平比較 與癌旁組織相比，肺腺癌組織上皮細胞標志物E-cadherin mRNA表達水平下調，差異有統計學意義（P=0.034）；而肺腺癌組織間質標志物Vimentin mRNA表達水平上調，差異有統計學意義（P=0.016）；此外，肺腺癌組織中誘導EMT的轉錄因子Snail和Slug mRNA表達水平亦上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 1。

圖1 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA在肺腺癌組織及癌旁組織表達情況（N：癌旁組織；C：癌組織）

2.2 EMT相關標識基因的表達水平與肺腺癌臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移者癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例高于無淋巴結轉移者（16/20 vs 44/97），而 Vimentin、Snail mRNA 表達水平上調者所占比例高于無淋巴結轉移者（15/20 vs 40/97，14/20 vs 37/97），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。IA 組 Vimentin mRNA表達水平上調者所占比例高于AIS+MIA組（52/86 vs 12/31），差異有統計學意義（P＜0.05）。含微乳頭結構（MPP）成分組癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例高于不含MPP成分組（27/37 vs 37/80），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表達水平上調者所占比例高于不含MPP成分組（26/37 vs 39/80，25/37 vs 37/80，28/37 vs 35/80），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌組相比，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌組癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例較高（23/39 vs 30/78），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表達水平上調者所占比例較高（26/39 vs 34/78，24/39 vs 33/78，27/39 vs 38/78），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

3 討論

全球范圍內肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[2]。近年來，肺腺癌已超過肺鱗狀細胞癌，躍居肺癌病理類型首位[3]。目前，針對肺腺癌的研究是肺癌研究領域的重要課題。2011年IASLC、ATS和ERS提出了AIS、MIA和IA的肺腺癌國際多學科新分類標準，為肺腺癌的診斷和治療提供了重要的指導[4-5]。腫瘤的侵襲和轉移被認為是惡性腫瘤的特征，也是臨床腫瘤治療失敗的主要原因[6]。因此，尋找有效的預測標志物尤為重要。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[7]。眾多研究表明，通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲等間質表型[8-11]。EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[12]。因此本研究分析117例肺腺癌患者的癌組織EMT相關標識基因的表達水平及與臨床病理特征的關系，旨在篩選出具有預測肺腺癌侵襲轉移的分子標志物及評估肺腺癌預后的新指標。

在EMT過程中，上皮細胞標志物E-cadherin表達水平下調，間質標志物Vimentin表達水平上調，以及誘導EMT的轉錄因子如Snail、Slug等表達水平亦上調。本研究顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調，Vimentin、Snail和Slug mRNA表達水平上調，差異均有統計學意義，本研究結果提示肺腺癌細胞具有間質表型。EMT作為腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，與腫瘤的轉移密切相關。本研究進一步分析了EMT相關標識基因的表達與淋巴結轉移的關系，結果發現有淋巴結轉移的肺腺癌患者，其癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例較高，而Vimentin、Snail mRNA表達水平上調者所占比例較高，差異均有統計學意義。2011年肺腺癌新分類標準中指出，相對于IA，通常將AIS和MIA劃分為非浸潤性腺癌。本研究結果表明，IA組Vimentin mRNA表達水平上調者所占比例較高，差異有統計學意義，提示惡性程度更高的肺腺癌病理亞型，其間質表型更明顯。在肺腺癌新分類中微乳頭狀肺腺癌（mi－cropapillary predominant lung adenocarcinoma,MPPAC）以其特殊的病理學特征被單列出定義為一種新的IA組織學亞型，并建議只要該成分所占比例達到5%就應該在診斷中進行描述。MPPAC因其高度的淋巴管侵犯、高淋巴結轉移等預后不良的生物學行為，近年來越來越受到臨床醫師、病理醫師及國內外學者的高度重視[13-15]，而關于MPPAC高淋巴結轉移的機制及相關因素的研究尚少。本研究以肺腺癌組織是否含MPP成分分為兩組，結果發現含MPP成分組癌組織E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例高于不含MPP成分組，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表達水平上調者所占比例高于不含MPP成分組，提示EMT可能是MPPAC高淋巴結轉移的機制之一。此外，本研究結果亦顯示，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌組織的E-cadherin mRNA表達水平下調者所占比例較高，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表達水平上調者所占比例較高，提示晚期肺腺癌具有間質表型，可能是其具有較高惡性程度的重要原因。

綜上所述，肺腺癌組織上皮表型相關標識基因表達水平下調，間質表型相關標識基因表達水平下調，尤其是在有淋巴結轉移患者、IA患者、含MPP成分者、晚期肺腺癌患者。本研究提示，肺腺癌組織EMT相關標識基因表達水平改變，且與淋巴結轉移、病理類型、腫瘤分期相關，提示其可能是評估肺腺癌預后的新指標及腫瘤治療的新靶點。由于本研究病例數較少，需要擴大樣本量進一步深入研究。

表1 EMT相關標識基因的表達水平與肺腺癌臨床病理特征的關系（例）

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