Ala -Gln二肽代替Gln提高綿羊體外受精胚胎發育能力試驗*

張奇波，皮文輝*

（1.克拉瑪依綠成農業開發有限公司，新疆 克拉瑪依 834000；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室/新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所）

L-谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是生物合成核酸的必須前體物質，是蛋白質合成與分解的調節物，是體內外早起胚胎發育的必須氨基酸[1-8]。Gln在哺乳動物雌性生殖道子宮液中呈現較高生理濃度[1-4]。Gln添加改善了哺乳動物小鼠、人、豬和牛的胚胎體外發育率[5-8]。

胚胎體外培養37℃環境中，氨基酸的代謝和氨基酸自然分解會釋放銨離子 （ammonium，NH4+）進入胚胎的周圍環境中[9]。小鼠和家畜早起胚胎體外培養研究顯示，由于銨的存在，胚胎的生理、發育和生存能力受到損害[9-12]，甚至影響出生個體健康狀態[9]。降低培養液氨基酸濃度或改變氨基酸形式，降低銨的蓄積，有利于改善胚胎發育環境[9，13]。

哺乳動物胚胎體外培養液添加Gln濃度一般是1 mmol/L或2 mmol/L。然而Gln化學穩定性差，會自然降解成銨和5-吡咯烷酮-2-羧酸 （5-pyrrolidone-2-carboxylic acid）[14]。用含 Gln 的二肽代替培養液中的Gln，能夠避免Gln自然分解產生的銨，降低培養液中銨的累積程度[9]。商品化的人用移植前胚胎培養液已經采用Gly-Gln （glycyl-L-glutamine）或 Ala-Gln（Alanyl-L-Glutamine）二肽代替 Gln[15]。Gln 二肽改善了小鼠[9，16，17]、豬[18-19]早期胚胎體外發育能力。

在含氨基酸的培養液中，綿羊囊胚培養產銨量顯著高于小鼠囊胚，間接表明反芻動物胚胎比嚙齒類胚胎需要代謝利用更多的氨基酸[20]。利用二肽代替Gln，降低培養液中銨的累積量，可能對綿羊胚胎體外培養產生積極影響。

1 材料和方法

1.1 卵母細胞體外成熟

將屠宰場獲得的綿羊卵巢放在裝有生理鹽水的保溫瓶中，2～4 h帶回實驗室。剪去卵巢周圍多余組織，用生理鹽水清洗2遍，帶入無菌間進行采卵。鑷子夾取卵巢置于采卵液 （M199+0.1%BSA+0.1 mg/mL肝素+0.1 mg/mL慶大霉素）中，用無菌手術刀片將卵泡切開。卵巢切割完成后，用手拉玻璃細管在體式顯微鏡下選取形態正常、胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體進行成熟。1 mL成熟液中 （M199+15%FBS+0.1 IU/mL FSH+0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL雌二醇）培養80枚/mL，培養條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度，成熟培養24 h。

1.2 卵母細胞體外受精

Percoll梯度離心法處理綿羊精液：從液氮罐中取出綿羊細管冷凍精液，放入39℃水浴解凍。用HSOF液配制90%和45%的Percoll梯度溶液，將解凍后的冷凍精液輕輕加在Percoll梯度液的表面，進行密度梯度離心（500 g 或 2 000 r/min，20 min）。沉淀精子再用5 mL HSOF（SOF+20 mmol/LHEPES+5 mmol/LNaHCO3+0.3%BSA）離心洗滌 （300 g或1 200 r/min，5 min）1次，去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至5×106個/mL用于體外受精。

受精前1～2 h在培養皿做好受精液小滴，每滴70 μL，覆蓋石蠟油，放入 CO2培養箱中平衡。SOF液是受精基礎液，添加2%（v/v）發情羊血清、2.9 mM乳酸鈣和16 μM異丙（去甲）腎上腺素[21]。在精子處理的同時，用200 μL移液器在原成熟盤中反復吹打培養成熟的卵母細胞和顆粒細胞復合體，使卵子間相互分離，去除部分顆粒細胞。卵子在HSOF中洗滌3次，受精液中洗滌1次。將30～50個卵母細胞移入受精液滴中，再用移液器吸取10 μL處理后的精液，加入受精液滴中，精子的最終濃度是5×106個/mL。然后將培養皿放入38.5℃、5%CO2和飽和濕度培養箱中過夜培養。

1.3 體外發育培養

發育液是NaHCO3緩沖的SOF溶液，添加1%（V ∶V）非必須氨基酸溶液（Sigma，M7145）、2%（V ∶V）必須氨基酸溶液（Sigma，B6766）、8 mg/mL BSA（Sigma，A3311）。對照組添加 Gln 2 mmol/L，實驗組添加 Ala-Gln 二肽 （Gibco，GlutaMAX 100×，35050061）2 mmol/L。受精后的合子用發育液清洗干凈，100～150枚/0.5 mL發育培養液中培養，培養環境是38.5℃、5%CO2飽和濕度。整個發育培養過程不換液。分別在培養的 24 h、48 h、120 h、144 h和168 h觀察，確定卵裂數、囊胚數和孵化囊胚數。

1.4 統計分析

用SPSS軟件統計分析，所有數據均表示為平均數±標準誤。胚胎分裂率、囊胚率和孵化囊胚率數據利用卡方檢驗進行分析，當P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 Ala-Gln二肽對綿羊體外受精胚胎發育的影響

為了分析Ala-Gla二肽對綿羊體外受精胚胎發育的影響，本實驗進行了7次對比實驗。每次實驗當天采集新鮮綿羊卵巢，從中收集質量好的卵母細胞進行體外受精，將體外受精后的合子，隨機分為Ala-Gln培養組和Gln培養組進行體外發育培養。每組培養的合子控制在100～150枚。培養24 h、48 h、120 h、144 h 和 168 h，分別觀察卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率。

表1 Ala-Gln或Gln對綿羊體外受精胚胎發育的影響

統計7次實驗結果并進行卡方檢驗。結果表明（見表1），受精卵體外培養24 h卵裂率差異不顯著（23.06±3.05 VS 19.80±4.06）。42 h卵裂率（86.17±2.97 VS 82.36±4.52）差異顯著。120 h和144 h的囊胚率差異顯著 （17.66±1.88 VS 13.29±1.67和31.85±1.80 VS 26.37±2.44）。168h孵化囊胚率差異不顯著（16.69±2.12 VS 14.90±1.95）。這些結果說明，在胚胎培養液中使用Ala-Gln代替Gln，可以有效提高綿羊胚胎在體外的發育能力。

3 討論

實驗表明，不同物種著床前的胚胎體內外發育能力都受到氨基酸的影響[1-8]。氨基酸已經成為早期胚胎發育培養液中普遍添加的成分。Garden和Lane報道，氨基酸對早期胚胎發育產生積極影響的同時，胚胎代謝氨基酸和37℃天然降解氨基酸，導致培養液中蓄積銨離子水平逐漸增加[22]。在添加必需氨基酸和非必須氨基酸，用Ala-Gln代替Gln的培養液中，兩細胞階段的胚胎，銨離子的積累幾乎可以忽略不計[23]。估計小鼠和牛囊胚代謝產生銨離子的速率分別是 1.0 pmol/胚胎/h和4.3 pmol/胚胎/h[22]。牛囊胚產銨離子速率比小鼠高很多，主要是歸因于代謝水平更高[24]。

Summers[25]等用Gly-L-Gln代替Gln培養小鼠胚胎，沒有影響囊胚率，但刺激了內細胞數量增加，可能對胚胎質量產生有益影響。Gly-L-Gln或Ala-L-Gln代替Gln的商品化人用胚胎發育液[15]和豬[18，19]胚胎發育影響研究，都表明二肽優于Gln培養結果。

本實驗表明，Ala-Gln代替Gln提高了綿羊卵母細胞體外受精卵裂率、囊胚發育率（見表1）。由于二肽化學穩定性高，商品化的Ala-Gln試劑為200 mM的液體，配制成2 mM工作濃度時，只需用移液器取適當體積溶液，不用稱量。而Gln化學穩定性差，試劑以固體形式保存，每次配制時需要稱量。因此，采用商品化的Ala-Gln溶液，免除了稱量Gln，簡化了綿羊體外受精發育液配制，改善了胚胎體外發育能力。

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