血管生成素樣蛋白4對M2型巨噬細胞分化的影響

吳丹丹, 丁時楨, 路國濤, 肖煒明, 龔衛娟

(1. 揚州大學醫學院 免疫學教研室, 江蘇 揚州, 225001;2. 揚州大學附屬醫院 消化科, 江蘇 揚州, 225001)

血管生成素樣蛋白(ANGPTL)是由Kim等于2000年首先發現的具有多功能的信號蛋白，與人血管生成素結構具有相似性。ANGPTL 4是ANGPTL家族重要成員之一，又被稱為禁食誘導脂肪因子(FIFA)、過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPAR)調節靶標等[1], ANGPTL 4以寡聚體、糖基化及各種亞型的形式存在，經細胞分泌后可直接進入血循環，在糖脂代謝、動脈粥樣硬化、調節血管發生、細胞分化、腎臟損傷等方面具有重要作用[2-3]。

巨噬細胞可分為2個亞群，即M1型和M2型。M1型巨噬細胞介導炎癥反應，在宿主防御細菌和病毒感染中發揮核心作用。M2型巨噬細胞參與抗炎反應、寄生蟲感染、組織重構、纖維化以及腫瘤疾病發展相關。腫瘤組織相關的M2型巨噬細胞主要通過分泌精氨酸酶、IL-10、血管內皮生長因子(VEGF)及金屬基質蛋白酶等促進腫瘤的生長和轉移[4-5]。ANGPTL 4已經被發現與結直腸癌、肝癌、乳腺癌、腎癌及頭頸癌等多種腫瘤的發病有關[6-8]。為探討ANGPTL 4是否通過調控M 2型巨噬細胞的分化而參與腫瘤免疫逃逸過程，本文利用ANGPTL 4特異性基因敲除小鼠及重組ANGPTL 4蛋白，觀察ANGPTL 4是否具備調節M 2型巨噬細胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

LPS購自Sigma-Aldrich公司, RPMI-1640培養基購自Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。重組ANGPTL 4蛋白來源于(R&D Systems), F4/80抗體(T45-2342)、CD4抗體(RM4-5)購自BD公司。CD206抗體(C068C2)、IL-4抗體(11B11)購自eBioscience公司。ANGPTL 4-/-鼠自美國NIH隸屬的突變小鼠資源和研究中心(MMRRC)引進, C 57BL/6小鼠來自揚州大學比較醫學中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟單細胞懸液的分離: 分別取8～12周ANGPTL 4-/-小鼠和對照C 57BL/6小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，浸泡于75%的酒精，在無菌操作臺中提取小鼠脾臟，加入預冷的無菌PBS中，研磨小鼠脾臟，去除血漬和外膜，于200目無菌濾網中過濾小鼠脾臟細胞，所得濾液移入50 mL離心管中。以4 ℃、1 500 轉/min離心5 min, 去除上清，加入1 mL紅細胞裂解液，吹打均勻，靜置10 min, 加入9 mL PBS終止裂解, 4 ℃、1 500 轉/min離心5 min, 去上清，根據實驗需求，進行下一步操作。

1.2.2 流式細胞術檢測和分選細胞: 按1.2.1方法制備脾臟單細胞懸液，用細胞計數板計數，按照每個EP管1×106個細胞分管，加PBS至每管100 μL, 按說明書要求劑量加入相應的熒光抗體F4/80, 4 ℃避光孵育30 min。加入800 μL PBS洗滌抗體, 4 ℃、1 500轉/min離心10 min, 棄上清，用400 μL PBS緩沖液重懸細胞，充分混勻，利用流式細胞儀檢測和分選F4/80+巨噬細胞。將分選所得F4/80+巨噬細胞移入胎牛血清封閉的50 mL離心管中保存，進行下一步操作。

1.2.3 巨噬細胞與T細胞共培養: 按1.2.2方法分選的巨噬細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育，加入LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 收集巨噬細胞，用細胞計數板計數。將巨噬細胞和CD4+T細胞按1∶2細胞數比例加入24孔板中, 37 ℃、5% CO2培養箱中共培養48 h。

1.2.4 胞內染色法檢測IL-4的分泌: 檢測前5 h, 將共培養于24孔板中的細胞，每孔加入2 μL cell stimulation cocktail(500×), 1 h后，加入BFA。4 h后，收集細胞移入EP管, 4 ℃、1 500轉/min離心5 min, 棄上清。1 mL PBS重新洗滌細胞, 4 ℃、1 500轉/min離心5 min, 棄上清，加入50 μL PBS, 以及CD4(0.5 mg/mL)抗體，充分混勻, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗滌，離心棄上清。每管加200 μL IC Fixation Buffer(eBioscience)重懸, 4 ℃避光孵育30～45 min, 每管加入1 mL 1×Permeabilization Buffer洗滌，離心棄上清。加入IL-4(0.2 mg/mL)抗體, 4 ℃避光孵30～45 min, 1 mL 1×Permeabilization Buffer再次洗滌，離心去上清。加入300 μL 1×Permeabilization Buffer重懸，待流式細胞儀(FACS Calibur)檢測。

1.2.5 重組ANGPTL 4蛋白刺激巨噬細胞: 按照1.2.2方法分選巨噬細胞，按照每孔5×105細胞數鋪至24孔板，加入重組ANGPTL 4蛋白(250 ng/mL), 在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，收集細胞移入EP管, 4 ℃、1 500轉/min離心5 min, 棄上清。加入F4/80、CD206(0.5 mg/mL)抗體，充分混勻, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗滌，離心棄上清。流式細胞術檢測脾臟中M2型(F4/80+CD206+)巨噬細胞的頻率。

1.2.6 統計學分析: 不同處理組之間的差異采取ANOVA分析方法，兩組之間的比較采取團體T檢驗分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細胞頻率的檢測

取8～12周生理狀態下的ANGPTL 4-/-小鼠和對照C 57BL/6小鼠，制備小鼠脾臟單細胞懸液，利用流式細胞術檢測脾臟中M2型(F4/80+CD206+)巨噬細胞的頻率。結果顯示，與對照組相比較, ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細胞頻率無明顯變化。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測ANGPTL4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細胞的頻率

2.2 LPS對ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2細胞分化的影響

分離ANGPTL 4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟單細胞懸液，體外培養, LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 通過流式細胞術檢測M2型(F4/80+CD206+)巨噬細胞的頻率。結果表明，與對照組相比, LPS刺激后, ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細胞的表達無明顯差異。見圖2。

圖2 LPS刺激后流式細胞術檢測M2型巨噬細胞的頻率

2.3 ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細胞對Th2細胞分化的影響

分離ANGPTL 4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟巨噬細胞，體外培養, LPS (1 μg/mL)刺激48 h, 將上述LPS刺激的巨噬細胞與CD4+T細胞按照1∶2的效靶比例共培養48 h, 流式細胞儀胞內染色法檢測CD4+T細胞IL-4的分泌。結果表明, ANGPTL 4-/-小鼠和C 57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細胞的內在活性無顯著性差異, ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細胞對Th2細胞分化無明顯影響。見圖3。

圖3 巨噬細胞與CD4+T細胞(1∶2)共培養后檢測CD4+T細胞IL-4的分泌

2.4 重組ANGPTL 4蛋白對M2細胞分化的影響

取C 57BL/6小鼠脾臟單細胞懸液，分別加入PBS和重組ANGPTL 4蛋白，用LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 流式細胞術檢測M2型巨噬細胞表達頻率。結果顯示，與PBS組相比，加入重組ANGPTL 4蛋白后, M2型巨噬細胞頻率無明顯變化(圖4)。分選C 57BL/6小鼠脾臟巨噬細胞，分別用PBS和重組ANGPTL 4(rANGPTL 4)蛋白處理, LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 將巨噬細胞與CD4+T細胞按照1∶2的效靶比例共培養48 h, 利用流式細胞術胞內染色法檢測CD4+T細胞IL-4的分泌。結果顯示，與PBS組相比，加入重組ANGPTL 4蛋白后, CD4+T細胞IL-4分泌無明顯差異(圖5)。

圖4 rANGPTL4蛋白處理后檢測M2型巨噬細胞的頻率

圖5 rANGPTL4蛋白處理后巨噬細胞與CD4+T細胞共培養檢測CD4+T細胞IL-4的分泌

3 討 論

本研究首先對生理狀態下ANGPTL 4-/-小鼠和C 57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細胞的頻率進行初步分析，發現M2型(F4/80+CD206+)巨噬細胞頻率無明顯變化; 經LPS刺激，發現ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細胞的表達無明顯差異; 同時，對M2型巨噬細胞的內在活性進行了探討，將經LPS刺激的ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細胞與T細胞共培養，發現T細胞IL-4的分泌無明顯差異，說明ANGPTL 4-/-小鼠脾臟內的M2型巨噬細胞不能誘導Th2分化; 繼而又用重組ANGPTL 4蛋白對C 57BL/6小鼠脾臟的巨噬細胞進行處理，將小鼠巨噬細胞與T細胞共培養，檢測M2型巨噬細胞表達頻率，以及T細胞IL-4的分泌情況，結果發現，與對照組相比，均無明顯差異，證實ANGPTL 4對M2型巨噬細胞的分化及其內在活性無關。

巨噬細胞分為M1型和M2型，其中M1型細胞以糖酵解供能為主，而M2型細胞則主要利用脂肪酸氧化磷酸化供能[9-10]。抑制巨噬細胞脂肪酸氧化磷酸化反應促進向M1細胞分化，如在脂肪組織維持和脂質代謝中發揮關鍵作用的Trib 1分子，對M2類巨噬細胞的分化具有重要影響[11]。ANGPTL 4已經被認為是能量穩態的各個方面的中心參與者，可以通過卷曲螺旋結構域抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)調節脂肪分解，而LPL可促進血漿富含TG的脂蛋白的清除[12], 從而升高ATP/AMP的比值。有研究[13]表明，通過激活PKC對ANGPTL 4的誘導可能在氣道重塑和脂質體內平衡的調節中起重要作用。同時, ANGPTL 4可能通過抑制下丘腦AMPK(AMP激活的蛋白激酶)活性作為厭食癥因子[14]。LKB1在T細胞活化，活力和代謝中起重要作用，并表明LKB 1-AMPK信號通過調節mTOR活性負調節效應T細胞功能[15]。前期，作者研究了ANGPTL 4-/-小鼠中M2型巨噬細胞表型及其內在生物學活性，以及ANGPTL 4是否影響M2型巨噬細胞分化。但ANGPTL 4基于哪條途徑影響AMPK的內在活性，從而參與糖脂代謝，以及ANGPTL 4是否通過能量代謝調節巨噬細胞活性的分子機制，仍有待進一步的研究。

ANGPTL 4被發現與多種腫瘤相關，如胃癌、腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、腦膠質細胞瘤等[16]。其纖維蛋白原樣結構域相互作用并激活特異性整聯蛋白以促進傷口愈合，調節血管通透性，并調節ROS(活性氧物質)水平以促進腫瘤發生[17]。此外, M2型巨噬細胞的極化在結腸腫瘤的發生和骨肉瘤的轉移中發揮著至關重要的作用[18-21]。作者目前只證實生理狀態ANGPTL 4對M2型巨噬細胞分化無影響，但在腫瘤微環境下, ANGPTL 4是否影響M2型巨噬細胞分化參與腫瘤免疫逃逸過程，尚待進一步研究。本研究證實血管生成素樣蛋白4(ANGPTL 4)不能調節M2型巨噬細胞的分化。

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