EP4基因沉默對甲狀腺乳頭狀癌K1細胞生長及遷移的影響

鐘榮譽 徐芬 艾鶴英 周丹莉 楊小穎 孫遼

1中山大學附屬第五醫院內分泌與代謝病科（廣東珠海 519000）；2中山大學附屬第三醫院內分泌與代謝病科，廣東省糖尿病防治重點實驗室（廣州 510630）

甲狀腺癌是目前內分泌系統最為常見的惡性腫瘤，流行病學調查顯示，近幾十年來其發病率逐步上升，已嚴重影響公眾健康［1］。而甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其最主要病理類型，約占79%～94%［2］。其中約5%～20%PTC患者經過傳統的手術、I131、TSH抑制等治療后，仍發生局部復發和遠處轉移，目前尚無有效的治療手段［3］。因此，通過尋找新的治療靶點，從而改善這部分患者預后顯得極為重要。

既往研究表明，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其關鍵合成酶環氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達升高且參與了其發生發展［4-5］。PGE2通過下游4種前列腺素E 受體（prostaglandin E receptor，EP）介導其作用，分別為EP1～4，其中前列腺素E受體4（prosta?glandin E receptor 4，EP4）與腫瘤關系密切，在多種腫瘤的生長、侵襲、轉移過程中發揮著重要作用［6］。同時我們前期研究發現，甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤組織及細胞株中EP4表達明顯升高［4，7］，提示其可能在甲狀腺乳頭狀癌發病中扮演著重要角色，但目前EP4與甲狀腺乳頭狀癌的關系尚不清楚。因此，本研究通過下調甲狀腺乳頭狀癌K1細胞中EP4的表達，研究其對K1細胞生長、遷移的影響，進一步了解EP4在甲狀腺乳頭狀癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株購自European Collection of Authenticated Cell Cultures（ECACC）。DMEM/F12培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰酶（GIBCO，美國）。陰性對照慢病毒及靶向沉默EP4慢病毒載體（上海吉凱基因有限公司），嘌呤霉素（Sigma?Aldrich，美國）。總RNA提取試劑TRIpure（Roche，瑞士），逆轉錄試劑盒（TAKARA，日本），SYBR Green I Mas?ter試劑盒（Roche，瑞士），引物合成（Invitrogen，美國）。總蛋白提取試劑RIPA裂解液、EDTA、蛋白酶抑制劑（thermo，美國），BCA蛋白定量試劑盒（ther?mo，美國），EP4抗體（Cayman，美國），GAPDH抗體（Proteintech Group，美國）。CCK?8試劑盒（Dojindo，日本）。Annexin V?APC/PI凋亡試劑盒（Invitrogen，美國）。Transwell小室（Corning，美國）。

1.2 細胞培養K1細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2濕潤培養箱中培養，定期進行換液及傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 慢病毒載體轉染K1細胞株實驗分為3組，分別為空白對照組（black control group，未轉染慢病毒）、陰性對照組（negative control group，轉染陰性對照慢病毒）和EP4沉默組（EP4 knockdown group，轉染靶向沉默EP4慢病毒）。取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，以2.5×105個細胞/孔接種于6孔板。鋪板過夜后，更換新鮮培養基，分別加入陰性對照病毒液、靶向沉默EP4病毒液進行細胞感染。繼續培養12 h后，更換為新鮮正常培養基。感染72 h后，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養基進行嘌呤霉素抗性篩選7 d。

1.4 QRT?PCR實驗采用TRIpure試劑裂解細胞，分別提取3組K1細胞總RNA，然后逆轉錄合成cDNA。按照qRT?PCR試劑盒說明書配制總體積為20 μL反應體系，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環；95℃反應5 s，65℃反應1 min。β?actin上游引物：5′?ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT?3′，下游引物：5′?CTTGCACATGCCGGAGCCGTT?3′；EP4 上游引物：5′?AATTCGTCCGCCTCCTTGAG?3′，下游引物：5′?CACCACCCCGAAGATGAACA?3′。β?actin作為內參基因，以 2?ΔΔCT法計算 EP4 基因 mRNA 的相對表達量。

1.5 Western blot實驗使用RIPA裂解液分別提取3組細胞總蛋白，并用BCA法進行蛋白定量，與5×上樣緩沖液混勻配平，煮沸變性后進行SDS?PAGE電泳。然后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h。TBS洗膜后，EP4（1∶200）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃下孵育過夜。TBS洗膜后，加入IRDye 800紅外熒光二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，Odyssey掃描成像系統顯像。采用Im?age?Pro Plus軟件進行圖像分析，GAPDH作為內參蛋白進行校正，以目的蛋白/內參蛋白的灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 CCK8實驗將3組K1細胞消化稀釋至濃度為5×104/mL的單細胞懸液，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，同時設空白調零孔，每組設置5個平行復孔。分別在培養24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK?8溶液，繼續培養2 h，用酶標儀在450 nm波長檢測其吸光度。

1.7 Annexin V?APC/PI凋亡實驗使用不含EDTA的胰酶消化細胞，每組分別收集5×105個細胞至流式管，200×g離心6 min，去除上清。分別用預冷1×PBS、1×Binding buffer各洗滌細胞1次。用100 μL 1×Binding buffer懸浮細胞后，加入5 μL AnnexinV?APC 溶液，室溫避光孵育 10 min。200×g離心6 min，去除上清。加入含5 μL PI溶液的1×Binding buffer 200 μL重懸細胞后，4℃避光進行流式細胞儀檢測。

1.8 Transwell細胞遷移實驗將3組細胞消化后，用無血清培養基稀釋至5×105/mL單細胞懸液，取100 μL細胞懸液加入transwell小室上室，下室加入500 μL完全培養基。在37℃，5%CO2培養箱中孵育12 h后，取出上室，棄去培養基，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min后，用棉簽擦去上室未遷移的細胞。0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌3次，顯微鏡下隨機選擇5個視野細胞并拍照計數。

1.9 統計學方法使用SPSS 13.0軟件統計分析，Graphpad Prism 6.0作圖，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 構建EP4基因沉默的K1細胞株QRT?PCR結果顯示，轉染了靶向沉默EP4慢病毒后，與陰性對照組比較，K1細胞EP4 mRNA表達水平顯著下調（P＜0.01），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。同時，Western blot結果顯示，EP4沉默組EP4蛋白表達明顯少于陰性對照組（P＜0.05），且兩對照組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。上述結果表明EP4基因沉默K1細胞株構建成功。

2.2 CCK8法檢測K1細胞生長情況成功構建EP4敲減的K1細胞株后，采用CCK8法分別于24、48、72 h檢測其細胞生長情況。結果顯示，EP4沉默組K1細胞的生長較陰性對照組受到明顯抑制（P＜0.01），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖1 各組K1細胞EP4 mRNA表達水平Fig.1 Expression of EP4 mRNA in each group of K1 cells

圖2 各組K1細胞EP4蛋白表達水平Fig.2 Expression of EP4 protein in each group of K1 cells

圖3 EP4 shRNA對K1細胞生長的影響Fig.3 Effect of EP4 shRNA on the growth of K1 cells

2.3 Annexin V?APC/PI法檢測K1細胞凋亡率采用AnnexinV?APC/PI雙染細胞后，使用流式細胞儀檢測3組細胞凋亡情況。結果顯示，EP4沉默組較陰性對照組其細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），空白對照組及陰性對照組間比較差異無統計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.4 Transwell法檢測K1細胞遷移能力慢病毒轉染細胞后，transwell結果顯示，EP4沉默組K1細胞遷移能力較陰性對照組顯著降低（P＜0.01），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 EP4 shRNA對K1細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of EP4 shRNA on the apoptosis of K1 cells

3 討論

前列腺素E2屬于花生四烯酸的衍生物，參與了肝癌［8］等多種腫瘤增殖、遷移、侵襲過程。已有研究表明，在甲狀腺乳頭狀癌中PGE2及其關鍵合成酶COX?2呈高表達［4］。研究發現，通過 COX?2抑制劑阻滯PGE2合成可以顯著抑制TPC?1細胞的生長、遷移和侵襲［5，9］。上述研究提示，PGE2在甲狀腺乳頭狀癌的生長、侵襲及轉移過程中發揮著重要作用。COX?2是催化花生四烯酸合成PGE2的關鍵限速酶，正常生理狀態下在大多數組織中表達很少，而在炎癥、腫瘤等病理過程中表達顯著增強［7，10-11］。多項臨床研究已發現抑制 COX?2 活性具有預防結直腸腫瘤的作用，但會增加消化道及心血管不良事件的風險，因此限制了其臨床應用，而其下游EP受體成為新的研究方向［12-14］。

圖5 EP4 shRNA對K1細胞遷移的影響（×200）Fig.5 Effect of EP4 shRNA on the migration of K1 cells（× 200）

EP4是PGE2下游受體的一種亞型，屬于跨膜G蛋白偶聯受體，在體內廣泛分布，參與了機體腫瘤形成、心肌肥大、血管舒張與重構、骨重構、胃腸道穩態、炎癥及腎和女性生殖系統功能調節等過程［6］。多項研究已證實EP4在結直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉移過程起著重要作用［15-16］。同時我們前期研究發現，與癌旁正常甲狀腺及良性結節性甲狀腺腫組織相比，甲狀腺乳頭狀癌腫瘤組織中EP4表達顯著升高［4］，這提示其可能參與了甲狀腺乳頭狀癌發病過程，但EP4表達水平與PTC的關系尚未闡明。

由于EP4對腫瘤細胞生長具有重要作用，EP4可通過磷酸化激活下游Akt等蛋白，從而影響腫瘤細胞生長［17］。而EP4對K1細胞生長的影響尚未清楚。因此，本研究通過慢病毒轉染技術，構建了EP4沉默甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株，以探討EP4對K1細胞生長的影響。結果顯示，通過慢病毒載體下調EP4蛋白表達后K1細胞生長受到顯著抑制。在PARIDA等［18］研究中發現GW627368X可選擇性阻滯EP4進而抑制宮頸癌細胞增殖及促進凋亡。同時在HANN等［19］研究中表明姜黃素可抑制頭頸部多種腫瘤細胞生長，其通過下調EP4表達而發揮其抗腫瘤作用，這些研究均表明EP4在抑制腫瘤細胞生長中具有重要作用，與本研究結論一致。此外，流式細胞術結果顯示EP4也參與了K1細胞凋亡過程，EP4蛋白表達下調后K1細胞凋亡顯著增加，這進一步證實了EP4基因沉默具有抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞生長的作用。細胞遷移是腫瘤進展轉移一個重要生物學過程，在ZHANG等［20］研究中發現EP4參與了腎癌細胞的遷移過程，敲減EP4可以抑制其腫瘤細胞遷移，延緩其進展。而甲狀腺乳頭狀癌K1細胞的遷移是否受到EP4調控尚不清楚，因此本研究進一步探討其對K1細胞遷移的影響。研究結果表明下調EP4表達可以明顯抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細胞遷移。上述結果提示EP4可能在甲狀腺乳頭狀癌發病中起著重要作用。

綜上所述，本研究成功構建了EP4基因沉默甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株，并發現下調EP4基因表達能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細胞生長及誘導其細胞凋亡，并明顯降低其細胞遷移能力。這提示靶向抑制EP4可能是治療人甲狀腺乳頭狀癌一種新的方法。EP4可通過多條信號通路發揮其作用，但EP4對K1細胞生長及遷移影響的機制目前尚不清楚，為此我們下一步將對其進行具體的機制探討。同時由于體外培養無法完全模擬體內環境，因此我們后續將進行體內實驗進行深入研究。

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