丙烯酰胺母源性暴露對仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43表達(dá)的影響

楊德慧 賴勝敏 古梓婷 劉鴻慶 馬宇昕 羅利 李國營 劉靖

廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（廣州 510006）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）是一種可溶于水的乙烯基單體，其復(fù)合體聚丙烯酰胺廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)［1］。業(yè)已證實ACR對人和動物具有神經(jīng)毒性，能夠選擇性地?fù)p害中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)的神經(jīng)元終末，出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、肢體乏力、四肢麻木、感覺障礙等一系列臨床癥狀［2］。然而關(guān)于ACR神經(jīng)發(fā)育毒性報道較少，胎兒和嬰兒正處于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重要階段，特別是血腦屏障尚未發(fā)育成熟，可能更容易受到各種有害因素的損傷，特別是神經(jīng)毒物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）和生長相關(guān)蛋白?43（growth associated protein?34，GAP?43）共同參與了神經(jīng)元生成和發(fā)育的全過程。其中，DCX是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元分化和遷移過程中階段性地表達(dá)于神經(jīng)元的突起和胞體上，其陽性細(xì)胞的數(shù)量可以反映海馬齒狀回新生神經(jīng)元的增殖情況［3］。另外，GAP?43是一種促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)與合成的胞膜上的特異性磷酸蛋白，能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸［4］。

因此，本實驗通過建立ACR母源性暴露，檢測仔鼠海馬齒狀回DCX和GAP?43的表達(dá)情況進(jìn)行探討ACR對神經(jīng)元的生長發(fā)育的影響，為研究ACR的神經(jīng)發(fā)育毒性提供理論和實驗依據(jù)，有利于優(yōu)生優(yōu)育。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ACR（美國Sigma公司，純度99.9%）、Rabbit Anti?DCX（美國 Abcam 公司）、Rabbit Anti?GAP?34（武漢博士德生物公司）、HRP標(biāo)記山羊抗兔（美國Ear thox公司）。

1.2 實驗動物6周齡級SD大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2013?0002。雌鼠32只，雄鼠16只，體質(zhì)量140～160 g，所有實驗動物在SPF級的條件下自由攝食和飲水，雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。

1.3 動物分組及染毒SD大鼠體成熟后，雌雄以1∶1進(jìn)行交配，孕鼠隨機(jī)分為4組，分別為對照組（0 mg/kg）、低（4.5 mg/kg）、中（9 mg/kg）和高（18 mg/kg）劑量組，每組8只。于母鼠妊娠第15天開始灌胃給藥，連續(xù)給藥至分娩后第13天，分娩后第14天，對仔鼠進(jìn)行取材。

1.4 動物取材仔鼠出生后第14天，在4%水合氯醛腹腔注射麻醉下，以0.9%生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛溶液灌注，灌注固定后取腦置于4%多聚甲醛中固定48 h，組織常規(guī)脫水和石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測切片常規(guī)脫蠟至水，在0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)20 min，3%H2O2?PBS室溫處理30 min，5%BSA封閉液37℃封閉30 min，于4℃冰箱孵育一抗過夜。次日滴加HRP標(biāo)記的二抗在37℃孵育40 min。DAB顯色4.5 min，切片置于ddH2O終止顯色。蘇木素染色15 s，自來水返藍(lán)2 min。切片繼續(xù)脫水后用中性樹脂封片。封片后選取每組每只大鼠2張切片，隨機(jī)選取3個視野，用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件計算免疫陽性表達(dá)物積分光密度值（IOD）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法利用Image pro?plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行光密度值分析，陽性表達(dá)物的平均光密度值，以表示，結(jié)果采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACR對P14仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達(dá)的影響 見圖1，GAP?43陽性表達(dá)物為黃棕色物質(zhì)，環(huán)繞細(xì)胞核分布，呈中空狀。GAP?43能夠調(diào)節(jié)軸突的生長，是神經(jīng)元發(fā)育過程中的標(biāo)志位之一。與對照組和低劑量組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43均明顯有減少（P＜0.01）。見圖2。

圖1 各實驗組仔鼠海馬GAP?43的表達(dá)情況（IHC×400）Fig.1 Effect of ACR on expression of GFAP in the hippocampal mother rats

表1 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回GAP?43表達(dá)的影響Tab.1 Effect of ACR on expression of GAP?43 in the hippocampal dentate of offsprings（n=8） x± s

2.2 ACR對P14仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響本實驗通過免疫組織化學(xué)方法檢測P14仔鼠海馬齒狀回中DCX的陽性表達(dá)來檢測神經(jīng)元突起形成的情況。與對照組相比較，ACR中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回DCX的陽性表達(dá)物均顯著減少（P＜0.01）。

3 討論

圖2 各實驗組仔鼠海馬DCX的表達(dá)情況（IHC×400）Fig.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal mother rats

表2 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

表2 ACR染毒對仔鼠海馬齒狀回DCX表達(dá)的影響Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

注：與對照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組IOD of DCX 9.37±0.70 7.75±0.39 6.21±0.33*4.43±0.56**

ACR是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原材料，廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。動物實驗業(yè)已證實ACR具有多種毒性，并在人體發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)毒性。ACR可以通過多種途徑進(jìn)行傳播，胎盤和哺乳亦是ACR傳播的方式［1］。ACR的神經(jīng)毒性具有累積性，低劑量長期染毒和高劑量短期染毒均可導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性［5］。ACR母源性暴露后，胎兒和嬰兒的健康與安全受到威脅［6］。海馬屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，不但與學(xué)習(xí)、記憶、情緒等相關(guān)，其中齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）更是神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)再生的重要部位之一。神經(jīng)干細(xì)胞位于海馬門區(qū)與顆粒細(xì)胞層之間的顆粒下層，新生成的神經(jīng)元從顆粒下層移入顆粒層，接受突觸傳入沖動，把軸突伸進(jìn)苔狀纖維通路，整合到海馬功能的神經(jīng)環(huán)路中，參與海馬的學(xué)習(xí)記憶等功能活動［7］。有研究顯示，母鼠通過飲水?dāng)z入ACR后，仔鼠海馬齒狀回Reelin免疫反應(yīng)細(xì)胞和谷氨酸脫羧酶67免疫反應(yīng)細(xì)胞呈劑量依賴性的增加，ACR干擾了海馬齒狀回神經(jīng)元的遷移和定位［8］。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，神經(jīng)元所分泌的蛋白GAP?43和DCX共同參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長與發(fā)育。因此，我們通過檢測仔鼠海馬GAP?43和DCX表達(dá)情況，研究ACR對神經(jīng)元發(fā)育的影響。

在本研究中，ACR暴露后，與對照組相比較，中、高劑量組仔鼠海馬齒狀回GAP?43的表達(dá)明顯下降。GAP?43是一種磷酸蛋白，特異性地表達(dá)于神經(jīng)元胞膜上，調(diào)節(jié)軸突的生長、突觸的形成和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［9-10］。在神經(jīng)元發(fā)育過程中，GAP?43引導(dǎo)軸突生長和調(diào)節(jié)突觸聯(lián)系中發(fā)揮著重要作用［9］。GAP?43表達(dá)的含量與軸突的生長、突觸的塑造狀態(tài)相一致［11］。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，GAP?43有較高的表達(dá)，被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個內(nèi)在決定因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長［12］。GAP?43的減少將降低軸突結(jié)構(gòu)的可塑性，包括軸突與樹突的發(fā)芽，其表達(dá)與神經(jīng)元軸突和樹突的功能呈正相關(guān)［13?14］。由此筆者推測，GAP?43表達(dá)減少后，神經(jīng)元軸突和樹突的發(fā)育受到了抑制。另外，本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，ACR暴露后仔鼠海馬齒狀回DCX亦顯著表達(dá)減少。DCX是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)元分化、遷移過程中階段性地表達(dá)于神經(jīng)元周圍的突起和胞體上，參與神經(jīng)元突起的形成與發(fā)育［3］。DCX可促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在神經(jīng)元遷移過程中控制著神經(jīng)元的聚合，穩(wěn)定細(xì)胞骨架［15］。DCX表達(dá)下降，提示ACR母源性暴露可能導(dǎo)致仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)生、分化受到抑制。有實驗報道，把ACR注射到小鼠體內(nèi)后，能夠抑制其海馬齒狀回增殖活性，新生神經(jīng)元減少［16］。ACR母源性暴露后，仔鼠海馬齒狀回GAP?43和DCX的表達(dá)均下降，提示ACR可能影響海馬神經(jīng)元的增殖、分化以及神經(jīng)元軸突的延伸。ACR的神經(jīng)發(fā)育毒性作用可能是多因素的，其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，母源性暴露后ACR能夠減少仔鼠大腦GAP?43和DCX的表達(dá)，可能抑制了海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育。而海馬區(qū)與學(xué)習(xí)、記憶等高級功能密切相關(guān)，ACR母源性暴露后可能會影響到仔鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力發(fā)展［17］。

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