食管鱗癌組織中TRIM28和p16的表達與臨床病理因素的關(guān)系

孫微 劉博 李秀娟 李坤 林媛媛 呂洋 李鳳玉

河北北方學(xué)院 1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，3病理教研室（河北張家口 075000）；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科（河北張家口 075000）；4解放軍251醫(yī)院腫瘤科（河北張家口 075000）

近年來，腫瘤已成為危害人類生命的頭號殺手，所有腫瘤中病死率位居第6位的是食管癌，其5年生存率 ＜20%［1］，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為最常見的組織分型［2］。目前，醫(yī)者對于腫瘤的治療主要著眼于手術(shù)及術(shù)后放、化療，在治療方式上已取得較大突破，但患者的總生存期改善效果不佳，大部分ESCC患者確診時已到晚期，且預(yù)后較差易轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，因此盡早找到治療ESCC的關(guān)鍵靶點迫在眉睫。三結(jié)構(gòu)域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）是近年發(fā)現(xiàn)的影響腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、遷移的重要調(diào)控家族，其中該家族成員TRIM28是腫瘤發(fā)展中主要的調(diào)節(jié)因子［3］。TRIM28可使細(xì)胞本身對DNA損傷的敏感性增強，進而阻止凋亡發(fā)生并調(diào)控細(xì)胞節(jié)律周期，研究表明TRIM28在宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種癌癥中均高表達，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)［3］。但目前國內(nèi)外尚未見TRIM28基因在食管癌中生物學(xué)作用的相關(guān)報道。p16基因又叫做多腫瘤抑制基因1（multiple tumor suppressor 1，MTS1），是一種直接參與細(xì)胞周期節(jié)律性調(diào)控的新型抑癌基因，其負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂衍生，p16基因缺失、突變將直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性生長［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn) p16基因在卵巢癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌等多種腫瘤中低表達，且與患者病理特征相關(guān)。本研究通過免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色技術(shù)，對136例ESCC患者腫瘤組織及37例距腫瘤邊緣5 cm以上的正常食管黏膜組織中的TRIM28和p16進行檢測，觀察ESCC中TRIM28和p16的表達情況及與臨床病理特征的相關(guān)性，從而為食管癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究應(yīng)用隨機的方式，收取2008年1月1日至2009年12月31日間河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院136例原發(fā)性ESCC患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，同時選取37例距癌組織邊緣5 cm以上的正常食管黏膜組織作為對照，經(jīng)病理證實對照標(biāo)本均未見癌細(xì)胞浸潤、細(xì)胞增生、炎癥等病變。136例原發(fā)性ESCC患者的臨床及隨訪資料均齊全，且在術(shù)前均未接受過其他治療，年齡27～80歲（中位年齡61歲），其中女45例，男91例。每一病例選擇相同的蠟塊取4 μm厚連續(xù)切片備用。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑兔抗人TRIM28多克隆抗體、鼠抗人p16多克隆抗體（America?Gene Tex公司）；枸櫞酸緩沖液、DAB顯色劑、PBS緩沖液、S?P免疫組化試劑盒（China?北京夢怡美生物科技公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗鼠IgG（America?Santa Cruz公司）；TritionX?100、DAPI顯色劑、抗體稀釋液（China?北京依諾凱生物科技公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色將標(biāo)本切片脫蠟水化，高壓加熱法進行抗原修復(fù)10～15 min，隨后滴加內(nèi)源性阻斷劑阻斷8 min；加入一抗使其將組織完全覆蓋（對照組織一抗用PBS代替，結(jié)果為陰性），4℃過夜后取出復(fù)溫25 min，PBS浸洗3次，嚴(yán)格按照試劑盒說明書順序依次滴加二抗等試劑；接著加入室溫下已配制的新鮮二氨基聯(lián)苯胺液（DAB液），顯色5 min；最后依次復(fù)染、脫水、封片固定。

結(jié)果判定：由兩位病理科主任醫(yī)師在雙盲的條件下評判全部免疫組化染色結(jié)果，并進行圖像采集；TRIM28和p16蛋白的陽性信號均主要定位于細(xì)胞核，胞核呈現(xiàn)染色一致的棕黃色顆粒或絲狀物判為陽性。權(quán)衡陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞的百分比大小及著色效果的強弱對染色結(jié)果進行判定：遵循隨機化的原則，選取5個高倍鏡視野分別計算每個視野下陽性細(xì)胞所占百分比并得出平均數(shù)，依陽性細(xì)胞數(shù)量所占百分比大小評為0～3分，陽性細(xì)胞＜10%評為0分，10%～49%評為1分，50%～74%評為2分，≥75%為3分；同理著色強弱也評為0～3分，無色評為0分，灰黃色評為1分，金黃色評為2分，棕黃色評為3分；最終將兩項評定標(biāo)準(zhǔn)所得分?jǐn)?shù)相加按總分進行陰陽分級：0～2分評為陰性，≥3分評為陽性。

1.2.3 免疫熒光染色向已脫蠟至水的組織標(biāo)本滴加1%TritionX?100進行破膜，隨后用枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)15 min，加入封閉液，用濾紙輕柔吸去組織表面封閉液，滴加一抗并覆蓋全部組織；4℃過夜后取出避光復(fù)溫25 min，以下操作均在暗室內(nèi)進行，PBS浸洗3次，滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗，隨后在37℃的條件下避光溫育45 min；加入新鮮配制的DAPI染色劑，室溫孵育15 min進行染色；最后PBS漂洗3次后封片，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

結(jié)果判定：在激光共聚焦顯微鏡下對圖像進行采集，呈陽性表達的細(xì)胞可見胞核部位顯現(xiàn)為黃綠色熒光（FITC），呈點狀分布；而陰性表達細(xì)胞的胞核可以被DAPI復(fù)染而顯現(xiàn)為藍色熒光，且整體背景清晰無其他著色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法所有資料數(shù)據(jù)結(jié)果均通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件加工處理。TRIM28及p16蛋白在ESCC組織中表達的特征與患者臨床病理表現(xiàn)的關(guān)系、兩種蛋白在正常食管黏膜組織及ESCC組織中表達量差異均用χ2檢驗分析處理；采用Spearman等級相關(guān)分析處理TRIM28及p16蛋白在ESCC組織中表達相關(guān)性。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM28及p16在兩種組織中的表達情況蛋白表達結(jié)果顯示，TRIM28的陽性率在ESCC組織（91.2%）高于正常食管黏膜組織（24%），而p16的陽性率在ESCC組織（32.4%）則低于食管黏膜組織（57%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1、2及表1。

圖1 TRIM28及P16在136例ESCC中的表達情況（SP×200）Fig.1 The expression of TRIM28 and P16 in 136 cases of ESCC（SP × 200）

2.2 TRIM28及p16的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系TRIM28及p16在ESCC的異常表達均與患者腫瘤的浸潤深度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.05）。具有高TNM分期、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表現(xiàn)且浸潤程度侵及全層的ESCC患者，其腫瘤組織中的TRIM28表達較強而p16表達較弱。見表2。

圖2 TRIM28及P16在37例正常食管黏膜中的表達情況（SP×200）Fig.2 The expression of TRIM28 and P16 in 37 cases of normal esophageal mucosa（SP × 200）

表1 TRIM28及p16在ESCC和正常食管黏膜組織中的表達情況Tab.1 The expression of TRIM28 and p16 in ESCC and normal esophageal mucosa 例

表2 TRIM28及p16的表達與ESCC患者病理情況的關(guān)系Tab.2 The expression of TRIM28，p16 and their relation to clincopathologic factors in esophageal carcinoma 例

2.3 免疫熒光染色結(jié)果激光共聚焦顯微鏡下觀察TRIM28及p16二者陽性信號在ESCC組織中的定位表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者在ESCC組織中均定位于胞核。見圖3。

圖3 TRIM28及p16在136例ESCC中的定位情況Fig.3 The location of TRIM28 and p16 in 136 cases of ESCC

2.4 TRIM28及p16在ESCC中表達的相互關(guān)系TRIM28與p16在ESCC組織中的表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.284）。TRIM28在p16陽性組中的表達率（79.5%）低于其在p16陰性組中的表達率（96.7%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。

3 討論

ESCC形成及惡化的生物學(xué)過程極為復(fù)雜，在諸多生理病理因素的影響下其病死率及術(shù)后復(fù)發(fā)率逐年攀升，而致其復(fù)發(fā)的根基在于癌細(xì)胞的侵襲遷移。在多種基因參與及多個生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的條件下癌細(xì)胞才能在其宿主體內(nèi)順利完成遷移，目前，研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因激活及抑癌基因失活的動態(tài)平衡失調(diào)將直接主導(dǎo)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［6］。HATAKEYAMA［7］發(fā)現(xiàn)TRIM家族的多位成員均以原癌或抑癌基因的身份作用于腫瘤細(xì)胞從而參與腫瘤生長的生物過程。TRIM28也被稱為TIF1β或KAP1，有研究報道，TRIM28是調(diào)節(jié)人類機能的樞紐站，其可在DNA損傷反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤反應(yīng)、病毒復(fù)制、細(xì)胞分裂分化等生物學(xué)進程中展現(xiàn)調(diào)節(jié)功能，例如TRIM28可通過修復(fù)DNA損傷反應(yīng)從而加速腫瘤細(xì)胞周期，行使類似原癌基因的功能促進腫瘤生長進展［8］。TRIM28不僅是一個穩(wěn)定的表觀遺傳基因，更是一個無處不在的過表達基因，其多種生物學(xué)功能及作用機制的相關(guān)研究是在癌癥研究基礎(chǔ)上進行的。ADDISON等［9］在細(xì)胞實驗研究中觀察到，乳腺癌細(xì)胞系中的TRIM28基因表達過高且其高表達有助于癌細(xì)胞尋找新的腫瘤微環(huán)境發(fā)生遷移。LIU等［10］通過克隆形成實驗、RNA干擾技術(shù)等研究表明在非小細(xì)胞肺癌組織中TRIM28基因表達上調(diào)，且當(dāng)TRIM28基因表達被siRNA阻斷后，肺腺癌細(xì)胞生長受到抑制。FITZGERALD等［11］采用細(xì)胞及臨床實驗相結(jié)合的方式對TRIM28在結(jié)直腸癌組織中的表達情況進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌中高表達，并可通過降低其表達的方式，實現(xiàn)對結(jié)直腸癌細(xì)胞衍生及遷移的控制。但目前國內(nèi)外罕見TRIM28基因在食管癌中表達情況的相關(guān)報道。本研究為回顧性研究，主要通過免疫組化技術(shù)檢測TRIM28在136例ESCC組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM28在食管癌的進程中扮演促癌基因的角色，其陽性表達率高達91.2%，與之相比其在正常食管黏膜組織中的陽性率僅為24%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本研究還發(fā)現(xiàn)TRIM28表達程度越高ESCC患者的TNM分期也越高，且多伴有腫瘤浸潤深達全層及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，表明TRIM28與ESCC的惡性進程相關(guān)。本研究結(jié)果顯示在ESCC中TRIM28表達水平顯著上升，且其高表達與患者腫瘤轉(zhuǎn)移惡化相關(guān)，這與上述前人研究其在宮頸癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤中表達上調(diào)的趨勢基本一致，再次驗證了TRIM28與腫瘤侵襲遷移的相關(guān)性，為尋找攻破腫瘤的作用靶點開辟新路徑。

p16基因位于人染色體9p21上，最常見的抑癌基因之一，包含2個內(nèi)含子及3個外顯子［12］。腫瘤方面的相關(guān)實驗研究表明，癌細(xì)胞株中p16基因發(fā)生突變或缺失，均促使p16蛋白合成受阻，從而造成細(xì)胞失控性增殖促進腫瘤衍生［13］。p16蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞周期節(jié)律調(diào)控的基因表達產(chǎn)物，是搭建各種腫瘤衍生和細(xì)胞節(jié)律異常之間的橋梁物質(zhì)之一。史恩溢等［14］研究發(fā)現(xiàn)p16基因在胃腸間質(zhì)瘤組織中表達明顯下調(diào)，且其表達隨腫瘤的衍生惡化而降低。NA等［15］探究p16蛋白在卵巢腫瘤中的表達情況時發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中p16的表達強度明顯低于正常卵巢組織，另外，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較無轉(zhuǎn)移患者的p16蛋白表達強度更低。本研究結(jié)果顯示，p16的陽性率在ESCC組織低于食管黏膜組織，且其表達與ESCC患者的TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度等相關(guān)，在TNM分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且腫瘤浸潤程度較深的患者組織標(biāo)本中檢測到p16表達強度均較弱，此結(jié)果與DEY等［16］的研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果還顯示：TRIM28與p16在ESCC組織中的表達呈負(fù)相關(guān)。p16在TRIM28陽性患者組織標(biāo)本中的表達率低于其在TRIM28陰性患者組織標(biāo)本中的表達率；此外，它們在ESCC組織中的定位將直接關(guān)系到其功能的執(zhí)行情況，本研究發(fā)現(xiàn)二者的陽性信號均定位于胞核，它們通過介導(dǎo)癌細(xì)胞周期節(jié)律紊亂，加速細(xì)胞周期促使癌細(xì)胞失控性增殖，進而參與腫瘤衍生進程。在此進程中，p16基因執(zhí)行抑癌功能的命令被阻斷，而TRIM28基因通過修復(fù)DNA損傷反應(yīng)加速腫瘤細(xì)胞周期，它們相互作用、相互影響，促進腫瘤細(xì)胞生長發(fā)揮類似原癌基因的功能，但具體機制還未研究清楚需進一步研究探討。

綜上所述，筆者認(rèn)為TRIM28與p16參與調(diào)控ESCC的發(fā)生及惡化，同時二者表達情況還與ESCC患者的TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度等病理特征相關(guān)，有可能成為ESCC靶向生物治療的重要靶點，并輔助ESCC早期診斷、臨床治療及患者預(yù)后評估，為攻破ESCC提供新思路、新依據(jù)。

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