二甲雙胍通過(guò)AMPK通道對(duì)界膜中滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和成骨作用的研究

陳坤 李奇

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州 510280）

無(wú)菌性松動(dòng)（aseptic loosening，AL））是關(guān)節(jié)假體移植發(fā)生松動(dòng)的主要原因之一，在假體與骨界面應(yīng)力過(guò)大就會(huì)產(chǎn)生一定的微動(dòng)［1］，達(dá)到一定的微動(dòng)程度就會(huì)抑制假體周?chē)堑拈L(zhǎng)入，從而形成一定的空隙而填充界膜。界膜主要含有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞（synovial fibroblasts，F(xiàn)LSs）、異物巨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和淋巴等細(xì)胞，其中成纖維細(xì)胞占到30%～70%［2］。FLSs與間質(zhì)干細(xì)胞具有同源性，具有成骨分化的潛力，有研究發(fā)現(xiàn)牙周成纖維細(xì)胞在周期應(yīng)力的刺激下有分化成骨的能力［3］。目前二甲雙胍對(duì)成骨和破骨作用研究集中在對(duì)巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞方面，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通道在多個(gè)組織、器官中對(duì)巨噬細(xì)胞有著明顯的抑制炎癥作用，如可明顯抑制巨噬細(xì)胞在脂多糖（LPS）和磨損顆粒誘導(dǎo)下的L?6、iNOS和OPG等溶骨炎癥因子的表達(dá)［4-5］。同時(shí)二甲雙胍和AICAR也促進(jìn)成骨細(xì)胞細(xì)胞外成骨，同時(shí)AMPK通道阻滯劑compound C能抑制成骨細(xì)胞細(xì)胞外成骨［6］?？梢?jiàn)AMPK通道對(duì)多種細(xì)胞都有著促骨生成的效能。同時(shí)磨損顆?？梢哉T導(dǎo)FLSs分泌RANKL/OPG比例的增高，促進(jìn)溶骨［7］。二甲雙胍在對(duì)細(xì)胞增殖抑制方面，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，并促進(jìn)其凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞的周期，例如對(duì)前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌Hep G2細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞等，通過(guò)LKB1?AMPK?mTOR通路直接抑制腫瘤的生長(zhǎng)和降低宿主胰島素水平間接作用于惡性腫瘤細(xì)胞［8-11］，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)成纖維細(xì)胞也表現(xiàn)生長(zhǎng)抑制的作用［12］。假體與骨間隙中的FLSs大量增殖形成界膜，界膜為巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞提供良好的微環(huán)境，同時(shí)FLSs本身增殖和在顆粒誘導(dǎo)下RANKL/OPG比例失調(diào)都是促進(jìn)假體松動(dòng)的重要原因。所以本研究致力于二甲雙胍對(duì)FLSs增殖和成骨方面，驗(yàn)證二甲雙胍抑制FLSs的增殖同時(shí)促進(jìn)FLSs成骨的作用，體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成骨活性特異性標(biāo)準(zhǔn)酶?ALP和細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)。二甲雙胍抑制界膜的增殖，促進(jìn)骨形成，有利于骨和假體的融合而穩(wěn)定假體，為臨床假體AL預(yù)防和治療提供新的思路，同時(shí)有利于老藥新用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑標(biāo)本取自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院關(guān)節(jié)外科年輕膝關(guān)節(jié)損傷患者關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中切除的滑膜，已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。胎牛血清（Gibico）、DMEN/F12培養(yǎng)基，I型膠原酶（sigma），兔抗人OPG抗體（abcam），兔抗人RANKL抗體（abcam），鼠抗人HIF?1α（cst），羊抗兔二抗（博奧森），羊抗鼠二抗（博奧森），兔抗人vimentin（H?84）（Santa CruzBiotechnology），兔 抗 人 CK18（Santa Cruz Biotechnology），羊抗兔二抗（中衫金橋）。兔SP試劑盒（中衫金橋），BCIP/NBT Kit（康為），茜素紅S染色液（索萊寶），鹽酸二甲雙胍（MedChem Express），AICAR（Inhibitor Expert），Compound C（MedChem Express），抗壞血酸（索萊寶），β?甘油磷酸（索萊寶），地塞米松（索萊寶）。超靈敏化學(xué)發(fā)光儀（Biorad），酶標(biāo)儀（Bio?tek）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FLSs的提取與鑒定將組織置于六孔板內(nèi)，用PBS漂洗三遍。移入潔凈的孔內(nèi)，滴入一滴全培液（含10%血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的DNMEM/F12培養(yǎng)基），眼科鑷將組織剪碎至1 mm×1 mm大小，加入2%Ⅰ型膠原酶3 mL，移入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h，每30 min輕輕震蕩樣本。四小時(shí)后將消化后的混合液體用直徑70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心濾液5 min，傾棄上清全。加入適量的全培液，移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，24 h后顯微鏡小觀察貼壁的細(xì)胞，并更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天更換新的培養(yǎng)基。待細(xì)胞覆蓋瓶底80%瓶底時(shí)，進(jìn)行傳代，取培養(yǎng)4或5代純化的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)形態(tài)觀察、角質(zhì)蛋白和波形絲細(xì)胞免疫化學(xué)染色對(duì)FLSs進(jìn)行鑒定。

1.2.2 二甲雙胍對(duì)FLSs生長(zhǎng)的影響取第4代的細(xì)胞行MTT檢測(cè)，以5×103/孔接于96孔板，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置：① 5個(gè)藥物濃度組：0、5、20、40、60 μmol/L和②3 μmol/L AICAR、20 μmol/L二甲雙胍，然后采取MTT檢測(cè)①②組在不同時(shí)間段對(duì)FLSs抑制的OD值，然后計(jì)算出抑制率；

1.2.3 二甲雙胍對(duì)FLSs的成骨誘導(dǎo)分化取第4代的細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)分化，以5×104/皿接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置：A、B和C組：A：空白，B：20 μmol/L 二甲雙胍，C：50 mg/L 抗壞血酸+0.1 μmmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉。再采用堿性磷酸酶染色檢測(cè)和茜素紅染色，分別檢查二甲雙胍促進(jìn)FLSs合成堿性磷酸酶和生成鈣結(jié)節(jié)的效能。其中堿性磷酸酶染色分別檢測(cè)3組（A、B和C組）培養(yǎng)7、14和21 d后堿性磷酸酶活性的結(jié)果；茜素紅染色分別檢測(cè)3組（A、B和C組）培養(yǎng)21、28和35 d后細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)形成的結(jié)果。

1.2.4 檢查二甲雙胍對(duì)FLSs信號(hào)通道AMPK的表達(dá)及磷酸化的影響取第5代的細(xì)胞行West?ern Blot檢測(cè)，以5×105/皿接種于10 cm的培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置①0、5、20、40 μmol/L 組和② 3 μMAICAR、20 μmol/L 二甲雙胍組，使用 Western Blot檢測(cè)不同藥物處理3 d時(shí)的FLSs的AMPK信號(hào)通道表達(dá)及磷酸化水平的情況。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)倒置顯微鏡下觀察FLSs培養(yǎng)第4代時(shí)的形態(tài)以及細(xì)胞免疫化學(xué)染色對(duì)FLSs的成纖維屬性鑒定結(jié)果。MTT檢測(cè)出不同組的OD值并計(jì)算出抑制率。倒置顯微鏡下觀察堿性磷酸酶染色和茜素紅染色結(jié)果。Western Blot檢測(cè)不同二甲雙胍和AMPK通道的激動(dòng)劑作用下通道AMPK表達(dá)及磷酸化水平情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異使用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色和細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果低倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，胞體比較大，也可見(jiàn)少量的多角細(xì)胞，胞核較大，核呈卵圓形和圓形，1～2個(gè)核仁（圖1A）。角質(zhì)蛋白細(xì)胞免疫化學(xué)染色呈陰性（圖1B）。波絲蛋白細(xì)胞免疫化學(xué)染色呈深棕色，呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖1C）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞免疫化學(xué)染色Fig.1 Cell morphology and immunocytochemicalstaining

2.2 MTT檢測(cè)結(jié)果二甲雙胍在一定濃度范圍內(nèi)濃度越高對(duì)FLSs的增殖抑制越明顯，有明顯的濃度依賴(lài)性，但在時(shí)間梯度方面，隨著作用時(shí)間的加長(zhǎng)二甲雙胍對(duì)FLSs的抑制沒(méi)有明顯的增強(qiáng)，當(dāng)二甲雙胍為60 μmol/L時(shí)，隨著作用時(shí)間抑制趨勢(shì)有著明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖2A）。濃度為3 μmol/L的AICAR作用FLSs也表現(xiàn)出來(lái)了明顯的增殖抑制趨勢(shì)作用（圖2B）。

圖2 MTT結(jié)果Fig.2 MTT Results

2.3 堿性磷酸酶和茜素紅染色結(jié)果用20 μmol/L的二甲雙胍和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉作用于FLSs 7、14和21 d，可見(jiàn)在7 d時(shí)，二甲雙胍組和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉組表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)FLSs合成堿性磷酸酶的趨勢(shì)，相對(duì)對(duì)照組陽(yáng)性趨勢(shì)明顯。同時(shí)表現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)性，作用時(shí)間越長(zhǎng)誘導(dǎo)合成堿性磷酸酶越明顯（圖3）。20 μmol/L的二甲雙胍和50 mg/L抗壞血酸+0.1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/Lβ?甘油磷酸鈉同時(shí)表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)FLSs細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)形成的趨勢(shì)，同時(shí)有著明顯的時(shí)間依賴(lài)性（圖4）。

2.4 Western Blot檢測(cè)結(jié)果不同濃度二甲雙胍作用FLSs 3 d，可見(jiàn)信號(hào)通路AMPK在FLSs總體表達(dá)量恒定，二甲雙胍能促進(jìn)AMPK磷酸化，同時(shí)有著明顯的濃度依賴(lài)性（圖5A）。3 μmol/L AICAR也能明顯的促進(jìn)AMPK的磷酸化（圖5B）。

3 討論

圖3 堿性磷酸酶染色Fig.3 Alkaline phosphatase（ALP）staining

假體的磨損顆粒誘導(dǎo)一系列的溶骨炎癥是引起無(wú)菌性松動(dòng)主要原因，隨著國(guó)內(nèi)關(guān)節(jié)假體置換患者基數(shù)增大，對(duì)無(wú)菌性松動(dòng)的預(yù)防和治療迫在眉睫。二甲雙胍是治療Ⅱ型糖尿病治療的一線藥，近期大量研表明二甲雙胍有著促進(jìn)骨生成和抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖的效能。二甲雙胍通過(guò)AMPK通道可促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨保護(hù)素分泌且抑制RANKL分泌，抑制破骨細(xì)胞的分化和活性，抑制UHMWPE誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞多種溶骨炎癥因子的釋放。同時(shí)二甲雙胍對(duì)多種腫瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，并促進(jìn)其凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞的周期。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制FLSs增殖生長(zhǎng)，其抑制效應(yīng)有著濃度依賴(lài)性，隨著濃度越大抑制率越大，并在濃度約為60 μmol/L抑制率達(dá)到50%。在AICAR作用于AMPK也可抑制FLSs的增殖，同時(shí)具有時(shí)間依賴(lài)性。二甲雙胍對(duì)FLSs的促骨效能方面，在二甲雙胍的作用下，能促進(jìn)FLSs成骨活性特異性標(biāo)志酶?ALP的合成和細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)的沉淀。在培養(yǎng)7 d時(shí)可見(jiàn)ALP活性明顯增強(qiáng)以及有著明顯的時(shí)間梯度。在21 d時(shí)可見(jiàn)明顯的細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)的沉淀，也有著明顯的時(shí)間梯度性。陽(yáng)性對(duì)照組（抗壞血酸、β?甘油磷酸和地塞米松合劑）FLSs培養(yǎng)7 d時(shí)也可見(jiàn)堿性磷酸酶合成明顯增加和21 d時(shí)細(xì)胞外出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，同時(shí)有著時(shí)間依賴(lài)性。二甲雙胍作用AMPK信號(hào)通道，促進(jìn)AMPK通道的磷酸化。二甲雙胍作用于AMPK通道，促進(jìn)其磷酸化，同時(shí)抑制下游重要靶點(diǎn)m?TOR的磷酸化，從而發(fā)揮抑制FLSs增殖和促進(jìn)FLSs成骨的生理功能。但有研究表明二甲雙胍通過(guò)IGF?1/PI3K/AKT/m?TOR發(fā)揮著間接作用，大量研究表明二甲雙胍通過(guò)該通道可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并阻滯其周期在G2期等期限［13］，再者二甲雙胍還能通過(guò)該通道抑制強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［14］。但對(duì)二甲雙胍是否也通過(guò)IGF?1/PI3K/AKT抑制m?TOR的磷酸化發(fā)揮間接作用而抑制FLSs增殖和促進(jìn)成骨的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。本研究也未對(duì)二甲雙胍作用AMPK通路后的下游通路展開(kāi)詳細(xì)研究。筆者后期要對(duì)二甲雙胍通過(guò)IGF?1/PI3K/AKT/m?TOR發(fā)揮著間接作用和二甲雙胍作用AMPK通路后的下游通路機(jī)制展開(kāi)詳細(xì)研究。國(guó)內(nèi)外目前集中在巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞方面的研究，在二甲雙胍對(duì)FLSs成骨和增殖方面尚未研究報(bào)道。本研究為臨床假體無(wú)菌性松預(yù)防和治療提供新的思路和靶點(diǎn)，同時(shí)有利于老藥新用。

圖4 茜素紅染色Fig.4 Alizarin Red S staining

圖5 Western BlottingFig.5 Western Blotting

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