利用回交和標(biāo)記輔助選擇快速培育高油酸花生品種及其評(píng)價(jià)

張照華，王志慧，淮東欣，譚家壯，陳劍洪，晏立英，王曉軍，萬(wàn)麗云，陳傲， 康彥平，姜慧芳，雷永，廖伯壽

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利用回交和標(biāo)記輔助選擇快速培育高油酸花生品種及其評(píng)價(jià)

張照華1，王志慧1，淮東欣1，譚家壯2，陳劍洪3，晏立英1，王曉軍4，萬(wàn)麗云1，陳傲2， 康彥平1，姜慧芳1，雷永1，廖伯壽1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；2湛江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東湛江 524094；3泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建泉州 362212；4江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221131）

【目的】高油酸育種是花生品質(zhì)改良的重要方向，利用回交育種結(jié)合標(biāo)記選擇可快速實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有推廣品種的高油酸化改良，探討利用這一技術(shù)體系進(jìn)行花生高油酸遺傳改良的實(shí)踐和效率。【方法】以目前推廣的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病品種中花16、中花21、泉花551、徐花13為輪回親本（母本，基因型AABB），以高油酸材料冀花13為非輪回親本（父本，基因型aabb）配制4個(gè)雜交組合，一年種植兩季并進(jìn)行人工雜交或自交，夏季在武漢種植，冬季在湛江南繁基地種植，通過(guò)1次雜交、4次回交和1次自交得到BC4F2后代。利用PCR產(chǎn)物測(cè)序方法，鑒定雜交和回交后代的基因型：根據(jù)回交后代基因型分離規(guī)律及與序列高度同源性的特點(diǎn)，用引物F0.7/R3在一個(gè)PCR反應(yīng)內(nèi)同時(shí)高效擴(kuò)增F1和回交后代（BC1F1-BC4F1）的和片段，并利用R3作為測(cè)序引物進(jìn)行反向測(cè)序，讀取測(cè)序峰圖判別基因型，在回交后代中篩選基因型AaBb的后代作為下代回交父本。自交后代（BC4F2-BC4F3）基因型鑒定采用KASP分型，獲得高油酸（基因型aabb）后代。對(duì)獲得的基因型為aabb的高油酸后代與其對(duì)應(yīng)輪回親本進(jìn)行重要農(nóng)藝性狀、品質(zhì)和重要抗病性的調(diào)查和SSR標(biāo)記檢測(cè)。【結(jié)果】在3年時(shí)間內(nèi)，4個(gè)組合分別獲得10、5、6、8株BC4F2高油酸純合隱性基因型（aabb）單株，通過(guò)一代自交獲得相應(yīng)的BC4F3株系，對(duì)獲得的高油酸株系與輪回親本進(jìn)行植物學(xué)、農(nóng)藝性狀、品質(zhì)和青枯病抗性的考察，最終，4個(gè)組合均獲得了與輪回親本綜合性狀最接近的株系，分別為ZJ019、ZJ109、ZJ160和ZJ805，其油酸含量為82.54%、79.85%、79.22%、和78.94%，可作為輪回親本對(duì)應(yīng)的高油酸新品種。另外，本研究還對(duì)中花16回交組合中獲得的高油酸株系的遺傳背景進(jìn)行了SSR分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ZJ019株系的回復(fù)率達(dá)94.8%，在該組合中回復(fù)率最高，這一結(jié)果與植物學(xué)、農(nóng)藝性狀鑒定的結(jié)果一致。【結(jié)論】利用連續(xù)回交、南繁加代和分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)可在3年內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有推廣花生品種的高油酸化改良。

花生；高油酸；回交；分子標(biāo)記輔助選擇；品種

0 引言

【研究意義】花生（L.）是中國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。近幾年，中國(guó)花生種植面積約4.67×106hm2，總產(chǎn)1.68×107t，約占世界花生產(chǎn)量的40%。國(guó)產(chǎn)花生原料的55%用于榨油，年產(chǎn)花生油2.6×105t，是國(guó)產(chǎn)植物油的第二大來(lái)源[1-2]。因此，中國(guó)是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國(guó)。花生種子中含8種主要脂肪酸，而油酸（45%—80%）、亞油酸（2%—35%）和棕櫚酸（6%—12%），這三種脂肪酸占比達(dá)到92%[3]。油酸含量是評(píng)價(jià)植物油品質(zhì)的重要指標(biāo)。油酸可以降低對(duì)人體健康有害的低密度膽固醇（low-density lipoprotein，LDL），同時(shí)不破壞對(duì)人體有利的高密度膽固醇（high-density lipoprotein，HDL），而且高油酸花生（油酸含量約80%）產(chǎn)品還可延長(zhǎng)貨架壽命[4-6]。但目前國(guó)內(nèi)主推的花生品種絕大多數(shù)為普通油酸含量（55%以下），高油酸花生品種較少，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)花生原料和加工產(chǎn)品的油酸含量低，品質(zhì)不優(yōu)[7]。因此，如何快速實(shí)現(xiàn)中國(guó)花生主推品種的高油酸化，已成為花生品種改良亟需解決的問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】花生油酸到亞油酸的轉(zhuǎn)化，主要由分別位于A09、B09染色體上的、兩對(duì)同源非等位基因控制[8]。目前，在花生中廣泛應(yīng)用的高油酸突變材料F435[9]，是由于的ORF-448 bp G/A替換和的ORF-441_442的“A”插入導(dǎo)致FAD2酶部分或全部失活，2個(gè)基因同時(shí)突變導(dǎo)致了花生高油酸性狀的產(chǎn)生[10-11]。目前，針對(duì)這兩個(gè)突變基因的特定突變位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的基因型鑒定方法主要有：1）CAPS標(biāo)記法；2）熒光定量PCR法；3）位點(diǎn)特異性PCR（Allele-specific，AS-PCR）法；4）競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）等[12-15]。上述方法均是鑒定的間接方法，由于、基因序列的高度相似性，導(dǎo)致鑒定結(jié)果具有一定比例的假陽(yáng)性，用于回交后代的檢測(cè)準(zhǔn)確性不高，并且由于鑒定方法需要用到內(nèi)切酶和熒光物質(zhì)、熒光PCR儀等設(shè)備，鑒定成本和操作技術(shù)復(fù)雜，因此需要建立更準(zhǔn)確的回交后代基因型鑒定方法。雜交育種是轉(zhuǎn)移和聚合優(yōu)良性狀的常用技術(shù)方法[16]，自從花生高油酸突變體F435被引入中國(guó)以來(lái)，國(guó)內(nèi)利用該突變體或其衍生材料，培育出了多個(gè)高油酸花生新品種，但這些新品種普遍存在產(chǎn)量較低、抗性不高、耐寒性差等問(wèn)題[17]。回交育種是改良推廣品種個(gè)別不良性狀的最為快速有效的方法，目前國(guó)內(nèi)推廣的主要花生品種均經(jīng)過(guò)生產(chǎn)上的廣泛種植，在一定生態(tài)區(qū)具有良好的適應(yīng)性，通過(guò)回交育種快速地將這些優(yōu)良的推廣品種轉(zhuǎn)育成高油酸品種，將加快中國(guó)花生高油酸品種的推廣和應(yīng)用進(jìn)程。【本研究切入點(diǎn)】中國(guó)高油酸花生遺傳改良起步晚，且目前培育的品種多為利用雜交和系譜法育成，雜交后代選擇和品系的適應(yīng)性評(píng)估周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致高油酸品種培育進(jìn)展緩慢，不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求。為此，需要建立簡(jiǎn)便高效的高油酸育種基因型鑒定方法和技術(shù)體系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】針對(duì)目前花生高油酸改良存在的問(wèn)題，本研究利用回交技術(shù)提高推廣花生品種的油酸含量，根據(jù)回交分離的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)回交后代基因型的簡(jiǎn)便高效鑒定，結(jié)合自交后代基因型的KASP分型技術(shù)，快速地獲得高油酸株系。同時(shí)，綜合利用植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀、抗病抗逆性鑒定和SSR標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)掘與輪回親本（推廣品種）高度相似的高油酸回交后代，以加速高油酸品種的培育和推廣進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 輪回親本（推廣品種） 1）中花16（ZH16，基因型AABB），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所選育，2009年通過(guò)國(guó)家鑒定和湖北省審定，2013年通過(guò)江蘇省鑒定，珍珠豆型中果早熟品種。含油量57.76%，油酸54.00%，亞油酸23.00%，為高產(chǎn)高油品種。2）中花21（ZH21，基因型AABB），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所選育，2009年通過(guò)湖北省審定，2015年通過(guò)國(guó)家鑒定，珍珠豆型中果早熟品種。含油量53.09%，油酸41.20%，亞油酸36.00%，為高產(chǎn)抗青枯病品種。3）泉花551（QH551，基因型AABB），福建省泉州市農(nóng)科所選育，2015年通過(guò)國(guó)家鑒定和福建省審定，珍珠豆型小果花生品種。高抗青枯病，百果重210.9 g，含油量50.9%,油酸含量49.40%，亞油酸含量31.80%，為高產(chǎn)抗青枯病品種。4）徐花13（XH13，基因型AABB），徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育，2008年通過(guò)國(guó)家鑒定，中早熟大粒花生品種，百果重234.2 g，含油量56.43%，油酸45.70%，亞油酸33.30%，為高產(chǎn)高油品種。

1.1.2 非輪回親本（高油酸基因供體） 冀花13（JH13，基因型aabb），河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油所選育，2010年通過(guò)國(guó)家鑒定，普通型中早熟小果，百果重191.2 g。油酸含量81.4%，亞油酸2.9%，屬高油酸小果花生品種。其高油酸基因來(lái)源是自然突變材料F435（基因型aabb）。

1.2 選育過(guò)程

雜交獲得F1代：以輪回親本為母本，非輪回親本為父本配置雜交組合，通過(guò)人工授粉獲得F1雜交種子，鑒定F1雜交種子的基因型，獲得F1真雜種（基因型AaBb）。

回交獲得BC1F1-BC4F1種子：以輪回親本為母本，以獲得的F1真雜種為父本進(jìn)行人工授粉，獲得BC1F1種子，鑒定BC1F1種子基因型，保留基因型為AaBb的BC1F1種子作為下一代回交的父本。重復(fù)回交直至獲得基因型為AaBb的BC4F1種子。

自交獲得BC4F2-BC4F3種子：將BC4F1種子（基因型AaBb）種植，自交獲得BC4F2種子，利用近紅外初篩單粒種子的油酸含量，保留65%以上的種子進(jìn)行基因型鑒定（KASP法）。為加快回交育種進(jìn)程，分別在湖北武漢種植春季雜交（4月—8月）、廣東湛江（11月—次年2月）進(jìn)行每年兩代人工雜交（圖1）。

圖1 高油酸花生回交育種流程

1.3 人工雜交方法

人工雜交父本一般比母本提前5天種植，以保證母本初花時(shí)有足夠的父本花粉供應(yīng)。母本初花后即可開(kāi)始人工雜交，一般每天下午16：00—18:00對(duì)母本上花萼微裂花瓣黃色、第二天早上能正常開(kāi)花的花蕾進(jìn)行人工去雄，去雄后除去本節(jié)位上的多余花苞，然后用棉線綁在該節(jié)位上以示標(biāo)記；次日清晨5：00—7：00父本花粉小心涂抹在去雄的母本花柱上，人工雜交一般持續(xù)15—20 d，人工雜交結(jié)束后一周用絲線標(biāo)記雜交成功的果針。

1.4 DNA的提取

葉片DNA提取：分別取1片未展開(kāi)的花生小葉，采用改良CTAB法提取[18]DNA。

花生子葉DNA提取：切取種子遠(yuǎn)胚端的40 mg組織（最好從一片子葉上切取），采用王傳堂等[19]方法提取DNA。

1.5 ahFAD2A、ahFAD2B基因型鑒定

根據(jù)回交育種不同世代的分離特點(diǎn)，采用不同的基因型鑒定方法。1）親本基因型的鑒定：用Sanger測(cè)序法鑒定親本材料的基因型。其中引物對(duì)Fad2A-F/ Fad2A-R用于單獨(dú)擴(kuò)增；Fad2B-F/Fad2B-R用于單獨(dú)擴(kuò)增，使用2個(gè)測(cè)序引物：Internal1和Internal2進(jìn)行雙向測(cè)序（表1）。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為2×SYBR? Premix Ex TaqTM（包含緩沖液，dNTPs） 25 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）2.5 μL和模版DNA 30 ng。PCR程序?yàn)?5℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。得到的PCR產(chǎn)物原液（未純化），送擎科生物公司測(cè)序。2）F1、BC1F1- BC4F1基因型的鑒定：雜交和回交后代種子采用廖伯壽[20]描述的PCR產(chǎn)物測(cè)序法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物：F0.7/R3。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為2×SYBR? Premix Ex TaqTM（包含緩沖液，dNTPs）25 μL、上下游引物（10 μmol·L-1），2.5 μL和模版DNA 30 ng。PCR程序?yàn)?5℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。得到的PCR產(chǎn)物原液（未純化），送擎科生物公司測(cè)序，以反向擴(kuò)增引物R3為測(cè)序引物。3）自交后代BC4F2- BC4F4：采用位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）方法進(jìn)行。取自交后代幼嫩的葉片，送去中玉金標(biāo)記公司，按照Z(yǔ)HAO[21]描述的方法進(jìn)行BC4F2等自交后代的基因型分型。隨后用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證KASP法鑒定獲得的aabb單株基因型（具體方法同親本基因型鑒定）。

表1 花生ahFAD2A、ahFAD2B的PCR擴(kuò)增引物名稱(chēng)、序列和擴(kuò)增目標(biāo)

1.6 油酸含量的測(cè)定（參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，GB/ T17377-2008測(cè)定）

脂肪酸提取方法：切取10—20 mg花生種子于10 ml玻璃管中，加入2 ml石油醚，超聲波震蕩30 min,再加入1 ml 0.4 mol·L-1NaOH-甲醇溶液，超聲波震蕩30 min，靜置，取上清。

氣相色譜儀Agilent 7890B測(cè)定油酸，色譜條件：DB-23色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣N225 ml·min-1，空氣 400 ml·min-1，燃?xì)釮230 ml·min-1。采用分流的方式進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比60﹕1，進(jìn)樣口280℃，檢測(cè)器280℃；程序升溫：起始溫度180℃，保持2 min，以10℃/min的速度升至190℃，保持1 min，再以5℃/min的速度升至200℃，保持1 min，再以20℃/min的速度升至220℃，保持6 min。

1.7 植株、農(nóng)藝性狀和抗病抗逆性的鑒定

aabb基因型的BC4F2-BC4F4材料與其輪回親本表型性狀的考察參照姜慧芳等[22]方法進(jìn)行。

1.8 SSR分子標(biāo)記的檢測(cè)

采用SSR方法檢測(cè)aabb基因型的BC4F2材料與其輪回親本分子水平近似性。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為20 ng DNA模板、Taq PCR SuperMix（由北京全式金生物公司提供，包含緩沖液、dNTPs、Taq酶）5 μL、正反引物（10 μmol·L-1）各1 μL。PCR擴(kuò)增采用Touchdown程序?yàn)?5℃3 min；95℃30 s，65℃30 s，（每循環(huán)1次降低1℃），72℃1 min，共10個(gè)循環(huán)；93℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用變性PAGE膠檢測(cè)[23]。

SSR標(biāo)記帶型統(tǒng)計(jì)和分析：與輪回母本一樣的帶型記為“1”，與父本一樣的帶型記為“2”，雜合記為“3”。回復(fù)率（recovering ratio of genetic background，RRGB）計(jì)算公式G(g)=[L+X(g)]/(2L)=1/2+(1/2)(X(g) /L)，G(g)指在g代的遺傳背景恢復(fù)率[24]；X(g)指在回交g代表現(xiàn)為輪回親本帶型的分子標(biāo)記數(shù)量；L指所分析的分子標(biāo)記數(shù)量，并用Powermarker V3.25做聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果

2.1 親本基因型鑒定

配置雜交組合前，采用Sanger測(cè)序法對(duì)4個(gè)輪回親本和高油酸供體材料（各10粒種子）分別擴(kuò)增（圖2）和鑒定和的基因型（圖3），結(jié)果表明，4個(gè)親本材料均為純合一致的AABB基因型，高油酸供體冀花13為aabb基因型。

2.2 基因型鑒定

雜交種子收獲后切取部分子葉提取DNA，并用PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法進(jìn)行了基因型鑒定（圖4和圖5），以去除假雜種（AABB）。4個(gè)組合F1總計(jì)收獲F1種子91粒，其中真雜種81粒（基因型AaBb），真雜種比例89.0%，除組合BO-04（XH13×JH13）真雜種率較低外，其他組合真雜種率均在90%以上（表2）。

A：ahFAD2A擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；B：ahFAD2B擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

A：AA基因型；B：BB基因型；C：aa基因型；D：bb基因型 A: AA genotype; B: BB genotype; C: aa genotype; D: bb genotype

圖4 F0.7/R3擴(kuò)增F1種子ahFAD2A和ahFAD2B-ORF片段電泳圖

A：母本（假雜種）基因型AABB；B：F1（真雜種）基因型AaBb

表2 雜交F1種子的獲得與基因型鑒定結(jié)果

2.3 回交后代種子的獲得及基因型鑒定

回交后代的基因型鑒定采用PCR產(chǎn)物測(cè)序法進(jìn)行。由于和的同源性很高，設(shè)計(jì)的F0.7/R3引物可同時(shí)擴(kuò)增2個(gè)同源基因499 bp的DNA片段（包含突變位點(diǎn)），用R3為引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的反向測(cè)序，理論上測(cè)序峰圖在的ORF-432應(yīng)該出現(xiàn)序列本身固有的C/A套峰。如果所有測(cè)序峰圖均出現(xiàn)ORF-432的C/A套峰，表明PCR擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)均同時(shí)擴(kuò)增了2個(gè)基因。如果測(cè)序峰圖在ORF-448位出現(xiàn)A/G的疊峰，則表明基因型Aa，否則判定為AA基因型；在同一測(cè)序峰圖中ORF-442位如果有A堿基插入，會(huì)導(dǎo)致442位點(diǎn)后的峰圖出現(xiàn)一個(gè)堿基的錯(cuò)位，判定基因型為Bb，否則判定為BB基因型。

在4個(gè)回交組合4個(gè)回交后代中總計(jì)檢測(cè)了689粒種子（表3），其中AaBb種子數(shù)170粒，約占24.7%（基本符合回交后代4種基因型1﹕1﹕ 1﹕1的分離比例）。總體來(lái)看，4種回交后代基因型中，AABB基因型個(gè)體偏多，推測(cè)可能原因?yàn)椴糠质来斯とバ鄄桓蓛簦`將母本（基因型AABB）自交的后代作為人工授粉的莢果進(jìn)行標(biāo)記所致，如泉花551的BC3F1世代，徐花13的BC2F1世代等。

2.4 自交后代基因型鑒定與油酸含量測(cè)定

2016年春在武漢種植從BC4F1植株上收獲自交的BC4F2種子，經(jīng)KASP分型鑒定（圖6），獲得aabb基因型植株數(shù)分別為10、5、6和8個(gè)株系，總計(jì)29株（表4）。同時(shí)也得到了基因型為AaBb、aaBb和Aabb的BC4F3代種子，后代分離可得到aabb基因型材料。再自交1繁殖代，最終4個(gè)組合分別獲得基因型為aabb的株系為16、39、38和8個(gè)。

表3 回交BC1F1-BC4F1獲得的種子數(shù)量與基因型鑒定結(jié)果

表4 BC4F2種子的KASP基因型分型結(jié)果

A：ahFAD2A基因分型結(jié)果：紅點(diǎn)表示基因型為aa，藍(lán)點(diǎn)表示基因型為AA，綠點(diǎn)表示基因型為Aa，粉點(diǎn)表示樣品信號(hào)未檢出，黑點(diǎn)表示未加模板的陰性對(duì)照（NTC）；B：ahFAD2B基因分型結(jié)果：紅點(diǎn)表示基因型為bb，藍(lán)點(diǎn)表示此處基因型為bb，綠色表示基因型為Bb

利用Sanger測(cè)序法對(duì)KASP分型獲得的基因型為aabb的種子進(jìn)行了確證性檢驗(yàn)，并利用氣相色譜法進(jìn)行了脂肪酸含量的測(cè)定，結(jié)果表明，KASP法獲得的29粒種子種有29粒的基因型為aabb，符合率100%，其油酸含量均在75%以上。

2.5 改良的高油酸材料近似性評(píng)價(jià)

2.5.1 表型評(píng)價(jià) 對(duì)獲得的BC4F4高油酸近等基因系和其輪回親本進(jìn)行表型評(píng)價(jià)，每個(gè)株系選取10個(gè)單株進(jìn)行植株性狀考種，含油量用FOSS近紅外測(cè)定株系混合樣（3次重復(fù)），青枯病抗性按照每個(gè)株系設(shè)置3次重復(fù)進(jìn)行自然病圃鑒定，計(jì)算平均存活率并換算為抗病級(jí)別。百果重、百仁重取株系的混合樣進(jìn)行考種，脂肪酸含量用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。利用上述數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)獲得的高油酸材料與其輪回親本的近似度，篩選最為接近的株系作為改良的高油酸品系（表5）。

表5 決選高油酸近等基因系與其輪回親本重要農(nóng)藝性狀、抗病性、品質(zhì)指標(biāo)的比較

經(jīng)表型性狀的綜合評(píng)價(jià)，ZH16-HO（ZJ019）與ZH16最為相似，在分枝數(shù)、百果重、百仁重、種子長(zhǎng)寬比、青枯病抗性上無(wú)顯著差異，主莖高、含油量略有降低，油酸提高到82.54%。ZH21-HO（ZJ109）與ZH21最相似，在主莖高、分枝數(shù)、種子長(zhǎng)寬比、青枯病抗性上無(wú)顯著差異，百果重變大，百仁重、含油量略有降低，油酸提高到79.85%。QH551-HO（ZJ160）與QH551最為相似，在主莖高、分枝數(shù)、百仁重、種子長(zhǎng)寬比、含油量、青枯病抗性上無(wú)顯著差異，僅百果重略有增大，油酸提高到79.22%。XH13-HO（ZJ805）與XH13最為相似，主莖高、分枝數(shù)、種子長(zhǎng)寬比、青枯病抗性上無(wú)顯著差異，百果重、百仁重高于親本，含油量略有下降，油酸提高到78.94%。

2.5.2 SSR標(biāo)記對(duì)后代遺傳背景的分析 挑選了均勻分布于花生染色體的1 263個(gè)SSR標(biāo)記[25-26]，在組合中花16×冀花13中，篩多態(tài)性，最終得到67個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，并用于BC4F2基因型為aabb的10個(gè)株系遺傳背景的評(píng)估。

從表6可以看出，中花16×冀花13組合BC4F2代高油酸單株的遺傳背景的回復(fù)率都達(dá)到83.5%以上，其中ZJ019的回復(fù)率最高94.8%，說(shuō)明高油酸后代的遺傳背景和輪回親本中花16已經(jīng)高度一致。

用軟件PowerMarker V3.25作聚類(lèi)分析得到依據(jù)遺傳距離的聚類(lèi)圖（圖7）。ZJ019與ZH16遺傳背景最接近；ZJ066和ZJ077次之；而ZJ017相差最大。最終，結(jié)合表型性狀的考察，選擇ZJ019為中花16的最優(yōu)高油酸近等基因系材料。

表6 中花16×冀花13組合高油酸單株遺傳背景回復(fù)率

圖7 中花16及其高油酸候選近等基因系聚類(lèi)

3 討論

高油酸育種是花生遺傳改良的重要方向，通過(guò)雜交和系譜育種，可培育出高油酸花生新品種，但目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的高油酸材料主要來(lái)源于美國(guó)，多為普通型匍匐小果材料，產(chǎn)量潛力不高，不符合中國(guó)花生生產(chǎn)和種植方式，用其作為雜交親本培育高油酸品種，后代分離周期長(zhǎng)，并且培育的品種需經(jīng)過(guò)多點(diǎn)試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)以評(píng)估其產(chǎn)量潛力、抗病抗逆性和適應(yīng)性[27]。以現(xiàn)有推廣品種作為輪回親本，采用回交育種結(jié)合標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可在3年內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)推廣品種的高油酸化改良，并且改良的高油酸品種在主要性狀、抗病抗逆性上與原有推廣品種相近，可直接在原有推廣區(qū)域種植，大大加快了高油酸品種的推廣進(jìn)程，降低了推廣風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)育的高油酸品種還可作為優(yōu)良親本材料用于下一步的高油酸品種改良。

基于花生突變位點(diǎn)進(jìn)行基因型鑒定已開(kāi)發(fā)出多種方法，如CAPS法、熒光定量法、AS-PCR法、KASP等，但不同的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。如已開(kāi)發(fā)的熒光定量法、AS-PCR法、KASP法，因、序列的高度相似性，均有一定的假陽(yáng)性率。而CAPS標(biāo)記法需要用到限制性內(nèi)切酶，成本較高且操作相對(duì)復(fù)雜。為此，本研究巧妙地利用了、序列的高度相似性，篩選出一對(duì)PCR擴(kuò)增效率高的引物F0.7/R3，用于同時(shí)擴(kuò)增和，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并讀取測(cè)序峰圖，可精準(zhǔn)地區(qū)分和鑒定回交后代中的4種基因型（AABB、AaBB、AABb和AaBb）[20]。但是由于和序列的相互干擾，也導(dǎo)致該方法也有一定的局限性，不能準(zhǔn)確區(qū)分Aa/aa和Bb/bb基因型，不能用于自交后代的基因型鑒定，該方法與KASP標(biāo)記法配合可完整高效地用于花生高油酸回交育種流程。

無(wú)論獲得F1還是不同回交世代的人工授粉過(guò)程，本研究一直將輪回親本作為母本，這樣做的益處有3個(gè)：其一，保證獲得的高油酸品系與其輪回親本相比，其細(xì)胞質(zhì)控制的遺傳物質(zhì)沒(méi)有變化。其二，由于采用人工授粉不可避免地會(huì)有花粉去不干凈導(dǎo)致的假雜種產(chǎn)生，以輪回親本（AABB）為母本，僅僅會(huì)產(chǎn)生一種基因型的假雜種（AABB），母本植株上收獲的基因型AaBb的后代均為人工授粉成功的真雜種。而如果將回交后代（AaBb）作為母本，一旦由于去雄不徹底而產(chǎn)生假雜種，假雜種（即母本自交）的基因型會(huì)非常復(fù)雜，其中AaBb基因型的假雜種可能會(huì)被誤選，并作為下一代回交親本，嚴(yán)重影響回交育種效果。其三，將AaBb基因型的人工雜交后代作為回交父本，不僅可在進(jìn)行回交時(shí)提供花粉，父本植株上自交的種子如F2、BC1F2-BC4F2也采用系譜法進(jìn)行選擇，從而可最大限度地利用不同的回交后代開(kāi)展高油酸育種工作。

從理論上講，回交4代的材料與其輪回親本相比，細(xì)胞質(zhì)遺傳完全相同，細(xì)胞核遺傳物質(zhì)有96%以上的一致性，但由于連鎖累贅導(dǎo)致后代回復(fù)率遠(yuǎn)沒(méi)理論上高[28]，尤其是一些數(shù)量性狀在回交后代中沒(méi)能得到完全保留，如中花16和徐花13的高含油量性狀在其回交后代獲得的近等基因系中均未能檢測(cè)到超親的材料。然而，對(duì)于作為質(zhì)量性狀的青枯病抗性，在中花21和泉花551的回交后代中得到很好的保留，本研究還發(fā)現(xiàn)同一回交組合不同株系之間、株系與輪回親本之間相比，在植株性狀、重要農(nóng)藝性狀、重要抗性、品質(zhì)指標(biāo)上仍有部分差異，SSR分析也證實(shí)了這一結(jié)論。與表型法相比，SSR標(biāo)記法是評(píng)判回交育種效率相對(duì)有效的方法，但由于SSR標(biāo)記畢竟只是整個(gè)基因組的一部分，用SSR評(píng)估的回交恢復(fù)率仍然有很多不足之處。

由于提高油酸可同時(shí)提升花生的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和貨架壽命，高油酸已成為當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)的花生品種改良重要目標(biāo)。然而，種子油酸含量的大幅提高是否會(huì)給花生產(chǎn)量、抗性和其他品質(zhì)指標(biāo)帶來(lái)一些不利的影響目前尚未研究清楚，僅有的研究表明高油酸花生受低溫影響發(fā)芽率顯著下降[29]，不同研究者也發(fā)現(xiàn)高油酸與普通油酸花生相比，其黃曲霉產(chǎn)毒抗性、棕櫚酸含量存在顯著差異[30-32]。本項(xiàng)目通過(guò)回交育種獲得的高油酸材料與其輪回親本可作為遺傳背景最為接近的近等基因系材料，是評(píng)價(jià)高油酸對(duì)其他重要性狀影響的可靠材料。

4 結(jié)論

利用連續(xù)回交，南繁加代和分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)可在3年內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有推廣品種的高油酸化改良。對(duì)植株、農(nóng)藝性狀和抗病性考察并結(jié)合SSR標(biāo)記檢測(cè)，回交獲得的高油酸后代與輪回親本高度相似，篩選出4個(gè)最優(yōu)回交后代株系ZJ019、ZJ109、ZJ160和ZJ805，作為4個(gè)優(yōu)良輪回親本中花16、中花21、泉花551和徐花13各自對(duì)應(yīng)的改良高油酸酸品種，其油酸含量分別為82.54%、79.85%、79.22%、78.94%，表明利用這一技術(shù)體系實(shí)現(xiàn)了推廣花生品種的高油酸化改良。

致謝：該研究得到“瑪氏-中國(guó)花生高油酸育種計(jì)劃”項(xiàng)目的資助，獲得瑪氏北京公司溫若愚博士, 瑪氏北美公司Victor Nwosu博士，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張新友、黃冰艷研究員和美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處作物保護(hù)和管理研究所Guo Baozhu教授在研究中所提供的幫助，在此表示感謝。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Fast Development of High Oleate Peanut Cultivars by Using Marker-Assisted Backcrossingand Their Evaluation

ZHANG ZhaoHua1, WANG ZhiHui1, HUAI DongXin1, TAN JiaZhuang2, CHEN JianHong3, YAN LiYing1, WANG XiaoJun4, WAN LiYun1, CHEN Ao2, Kang YanPing1, JIANG HuiFang1, LEI Yong1, LIAO BoShou1

（1Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;2Zhanjiang Institute of Agricultural Sciences, Zhanjiang 524094, Guangdong;3Quanzhou Institute of Agricultural Sciences, Quanzhou 362212, Fujian;4Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai District, Xuzhou 221131, Jiangsu）

【Objective】The objectives of this research were (i) to establish an effective backcrossing approach combined with marker-assisted selection (MAS) of peanut high oleate breeding, (ii) to transform the elite peanut cultivars with normal oleate (NO) into high oleate (HO) ones in three years.【Method】Four cross combinations were designed named as BO-01, BO-02, BO-03 and BO-04 by selecting the elite peanut cultivars ZH16, ZH21, QH551 and XH13 with AABB genotype as recurrent parents, while JH13 with aabb genotype was selected as the high oleate donor parent. Via 1 cross, 4 backcrosses and 1 self-crossing,BC4F2progenies were obtained.According to the separation rule of backcross and high homology sequence ofand, F1and backcross progenies (BC1F1-BC4F1) were genotyped by sequencing of PCR products, in whichandwere amplified in one PCR reaction with F0.7/R3 primer pairs. AaBb genotype progenies were selected and used as male parent in next generation backcross. Self-crossing progenies (BC4F2- BC4F3) were examined by KASP (kompetitive allele specific PCR) to obtain aabb genotype progenies.Main agronomic traits, quality characters and disease resistance of aabb genotype progenies were investigated.The geneticbackgrounds of progenies with aabb genotype derived from ZH 16×JH13 were evaluated with SSR markers. 【Result】In summary, during 3 years, we obtained 10, 5, 6 and 8 high oleate progenies with aabb genotype in 4 cross combinations,respectively. By evaluating their agronomic traits, quality and bacterial wilt resistance,high oleate peanut cultivars were obtained, which were highly consistent with their corresponding recurrent female parent. ZJ019, ZJ109, ZJ160 and ZJ805 witholeic content as 82.54%, 79.85%, 79.22% and 78.94%, are regarded as high oleic cultivars of ZH16, ZH21, QH551 and XH13.【Conclusion】By using backcross, off-season multiplication for advancing generation and molecular marker selection, normal oleate peanut cultivars were successfully and quickly transited into high oleate ones within 3 years.

peanut; high oleic acid; backcross; marker-assisted selection (MAS); cultivar

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.003

2017-12-01；

2018-02-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（31671734，31071456，31371662，31461143062）、國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-13）、國(guó)家“863”計(jì)劃（2013AA102602）

張照華，E-mail：zhaohuazhang9121@126.com。

雷永，E-mail：leiyong@caas.cn。 通信作者廖伯壽，E-mail：lboshou@hotmail.com