蘋果褪綠葉斑病毒RT-LAMP檢測方法的建立

張雙納，李正男，范旭東，張尊平，任芳，胡國君，董雅鳳

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蘋果褪綠葉斑病毒RT-LAMP檢測方法的建立

張雙納，李正男，范旭東，張尊平，任芳，胡國君，董雅鳳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）

【目的】建立一種利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技術(shù)簡便、快速檢測蘋果褪綠葉斑病毒（, ACLSV）的方法?！痉椒ā吭贏CLSV基因組序列的3個保守區(qū)域設(shè)計3組引物，每組引物包括一對外引物（F3/B3）和一對內(nèi)引物（FIP/BIP），從3組引物中篩選出一組效果最好的引物。對RT-LAMP反應(yīng)體系，即Mg2+、dNTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3濃度進(jìn)行優(yōu)化，Mg2+濃度梯度設(shè)置為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L-1，dNTPs濃度為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1，Betaine濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1，F(xiàn)IP/BIP濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1，F(xiàn)3/B3濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1；優(yōu)化RT-LAMP反應(yīng)條件，采用已優(yōu)化的反應(yīng)體系，設(shè)置65、63、61、59、57℃ 5個不同的反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間設(shè)定為90 min。在引物篩選和反應(yīng)體系反應(yīng)條件優(yōu)化過程中，使用熒光定量PCR儀，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個反應(yīng)過程，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷反應(yīng)結(jié)果。以攜帶蘋果莖溝病毒(，ASGV)、蘋果莖痘病毒(，ASPV)、蘋果花葉病毒 (, ApMV)的植株葉片中提取的總RNA為模板測試RT-LAMP檢測方法的特異性。將含ACLSV的葉片總RNA原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以RNA原液和10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液作為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，測試RT-LAMP檢測方法的靈敏性。隨機(jī)采集23株蘋果樹的葉片，同時進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測，加入SYBR GreenⅠ進(jìn)行可視化檢測?！窘Y(jié)果】建立了ACLSV RT-LAMP檢測方法，優(yōu)化的檢測體系為：6.0 mmol·L-1Mg2+、1.2 mmol·L-1dNTPs、0.2 mol·L-1Betaine、1.6 μmol·L-1FIP/BIP和0.2 μmol·L-1F3/B3引物，最佳反應(yīng)條件為59℃，60 min。特異性檢測中，僅ACLSV檢測結(jié)果為陽性，對照組均為陰性。靈敏性檢測中，RT-LAMP方法最低可檢測到10-3RNA稀釋液,靈敏度是RT-PCR方法的100倍。隨機(jī)采取的23株蘋果葉片樣品RT-PCR陽性檢出率為52.2%，RT-LAMP陽性檢出率為65.2%，RT-LAMP的檢出率高于RT-PCR?！窘Y(jié)論】建立的ACLSV RT-LAMP檢測方法具有簡便、快速、靈敏性高、成本低等特點，可滿足基層、科研部門在田間調(diào)查、種苗繁育和海關(guān)檢疫中快速檢測ACLSV。

蘋果；蘋果褪綠葉斑病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；real-time PCR; 病毒檢測

0 引言

【研究意義】蘋果褪綠葉斑病毒（，ACLSV）是一種重要的落葉果樹病毒病原，在世界各地水果產(chǎn)區(qū)廣泛分布[1]，可侵染蘋果[2]、梨[3]、杏[4]、桃[5]、櫻桃[6]、李子[7]等多種果樹，對果樹生長和果實產(chǎn)量、品質(zhì)造成一定的影響。高效靈敏的檢測技術(shù)是病毒病防控的基礎(chǔ)，可為無毒苗木培育和推廣提供重要保障[8]。【前人研究進(jìn)展】在ACLSV檢測技術(shù)中，指示植物法費時費工[9]；酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法簡單低廉[10]，但ELISA檢測效果受抗體質(zhì)量限制[11]；目前，PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，但RT-PCR的靈敏性受到限制[12]；RT-nested PCR檢測敏感性和特異性較高，但需要進(jìn)行兩輪PCR，操作較為繁瑣、耗時較長[13-14]；real-time RT-PCR比RT-nested PCR的檢測敏感性和特異性更高，且后續(xù)不需要電泳檢測，但需較為昂貴的熒光定量PCR儀，實驗及儀器操作也需要專業(yè)指導(dǎo)，不利于廣泛應(yīng)用[15-16]。ACLSV在大多數(shù)寄主植物中潛伏侵染，在寄主葉片和果實上不表現(xiàn)明顯癥狀[17-18]，所以無法通過癥狀觀察進(jìn)行初步診斷，而且病毒在樹體中的含量一般很低，有時會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[19]。因此，開發(fā)一種更加靈敏、簡便的ACLSV檢測方法十分必要。LAMP是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)采用4條特異性引物識別靶序列上的6個特異區(qū)，利用DNA置換聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件下對靶基因擴(kuò)增[20]，RT-LAMP是在LAMP的基礎(chǔ)上加入反轉(zhuǎn)錄酶，使得反轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增同時進(jìn)行[21]。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可以進(jìn)行電泳檢測（陽性出現(xiàn)瀑布狀條帶，陰性樣品無條帶），也可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR greenⅠ核酸染料直接觀察顏色變化（陽性為綠色，陰性為橙色）或LAMP反應(yīng)也可以在實時濁度儀（擴(kuò)增超過閾值為陽性（有核酸擴(kuò)增），未超過閾值為陰性（無核酸擴(kuò)增））[22]和實時熒光定量PCR儀（若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性（有核酸擴(kuò)增），若無“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性（無核酸擴(kuò)增））中進(jìn)行，直接根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷反應(yīng)結(jié)果，此方法適用于有條件的實驗室。近年來，LAMP方法已逐漸應(yīng)用于各種動物、植物體的病原微生物以及外源基因的檢測中[23-27]?！颈狙芯壳腥朦c】使用熒光定量PCR儀，對ACLSV RT-LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對此方法的靈敏性、特異性和應(yīng)用特點進(jìn)行評價?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立ACLSV的RT-LAMP檢測方法，以期為該病毒的田間檢測和防控提供更好的技術(shù)支持，同時也可在開展無病毒苗木培育和生產(chǎn)的科研單位及企業(yè)推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

試驗于2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心實驗室完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 生物材料 用于LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化的植株樣品為實驗室保存的經(jīng)RT-PCR和ELISA鑒定為ACLSV陽性的富士蘋果組培苗；在特異性反應(yīng)中，感染蘋果莖溝病毒（，ASGV）、蘋果莖痘病毒（，ASPV）、蘋果花葉病毒（，ApMV）樣品和健康植株均為實驗室保存的經(jīng)RT-PCR和ELISA鑒定的富士蘋果組培苗；田間樣品采自遼寧省興城市的果園。

1.1.2 主要試劑和器材 BIO-RAD實時熒光定量PCR儀（型號：CFX ConnectTMOptics Module）；Bst DNA聚合酶購自NEB公司，隨酶提供100 mmol·L-1MgSO4和10×等溫緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1(NH4)2SO4，50 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1MgSO4，0.1% Tween-20，ph 8.8）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，10 mmol·L-1dNTP購自TaKaRa公司，Betaine購自Sigma-Aldrich公司，熒光試劑購自廣州迪澳生物公司，DL2000 Plus DNA Marker購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，DEPC處理水購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取 稱取蘋果葉片樣品50 mg，采用柱式法從采集的蘋果葉片樣品中提取總RNA。采用Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀測定提取總RNA的濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整性，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank公布的18條ACLSV基因組序列，通過Vector NTI軟件進(jìn)行同源性分析，分別在3個相對保守的區(qū)域設(shè)計3組RT-LAMP檢測引物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），并設(shè)計一對RT-PCR檢測引物（表1）。上述引物由上海生工生物公司合成。

表1 RT-LAMP和RT-PCR檢測ACLSV所用引物

1.2.3 RT-PCR檢測 反轉(zhuǎn)錄體系為1.0 ng RNA、1.0 μL 2 μmol·L-1oligod (T)18、DEPC水補至10 μL，65℃ 5 min；體系中加入4.0 μL M-MLV 5×buffer、4.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、1.0 μL M-MLV，42℃ 60 min，70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系為2.0 μL cDNA模板、2.5 μL 10×PCR buffer、2.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、1.0 μL rTaq、10 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL、DEPC水補至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；90℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.4 RT-LAMP檢測方法建立 RT-LAMP基本檢測體系以100—200 ng·μL-1的RNA為模板進(jìn)行，各成分含量如下：10×Isothermal Amplification Buffer、6.0 mmol·L-1MgSO4、1.4 mmol·L-1dNTPs、1.6 μmol·L-1FIP/BIP Primers、0.2 μmol·L-1F3/B3 Primers、320 U·mL-1Bst DNA聚合酶、40 U M-MLV、熒光染料、1.0 μL模板RNA、DEPC水補至25 μL。反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.0 μL 100 mmol·L-1MgSO4，3.5 μL 10 mmol·L-1dNTPs，1.0 μL 40 μmol·L-1FIP/BIP Primers，1.0 μL 5 μmol·L-1F3/B3 Primers，1.0 μL Bst DNA聚合酶，0.2 μL M-MLV，0.5 μL熒光染料，1 μL RNA模板，DEPC補至25 μL。反應(yīng)條件為63℃，70 min。

采用表1中3組引物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）用于上述RT-LAMP基本反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，確定適宜的引物。

RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化，Mg2+濃度梯度設(shè)置為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L-1，其余組分按RT-LAMP基本反應(yīng)體系添加，DEPC補至25 μL（下同）；采用最適Mg2+濃度，dNTPs濃度梯度設(shè)置為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1；采用最適Mg2+濃度和dNTPs濃度，Betaine濃度梯度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1；采用最適Mg2+濃度、dNTPs濃度和Betaine濃度，F(xiàn)IP/BIP濃度梯度設(shè)置為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1；采用最適Mg2+濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度和FIP/BIP濃度，F(xiàn)3/B3濃度梯度設(shè)置為0、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1。

RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化，采用已優(yōu)化的反應(yīng)體系，設(shè)置65、63、61、59、57℃5個不同的反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間設(shè)定為90 min。

以上RT-LAMP反應(yīng)均以實驗室保存的ACLSV陽性組培苗為樣品，在實時熒光定量PCR儀中進(jìn)行，根據(jù)擴(kuò)增曲線出峰快慢和曲線的光滑程度確定最適反應(yīng)條件。

1.2.5 RT-LAMP特異性驗證 采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對常見的蘋果病毒進(jìn)行檢測。以感染ASGV、ASPV、ApMV、ACLSV、健康植株葉片的RNA為模板，以無菌水為空白對照進(jìn)行RT-LAMP特異性檢測。通過觀察實時熒光定量擴(kuò)增曲線，肉眼觀察加入2.0 μL 1 000×SYBR GreenⅠ后反應(yīng)液顏色變化（綠色為陽性，橙色為陰性）、瓊脂糖凝膠電泳（出現(xiàn)特征性梯狀條帶為陽性，否則為陰性）等方法判定結(jié)果。

1.2.6 RT-PCR和RT-LAMP靈敏性檢測 提取感染ACLSV葉片總RNA，濃度為408 ng·μL-1，10倍濃度梯度稀釋至10-6，以無菌水為空白對照采用RT-LAMP和RT-RCR進(jìn)行檢測靈敏度對比試驗。采用肉眼觀察加入2.0 μL 1 000×SYBR GreenⅠ后反應(yīng)液顏色變化和瓊脂糖凝膠電泳分析判定結(jié)果。

1.2.7 ACLSV田間樣品檢測 在遼寧省興城市的果園中隨機(jī)采集23個蘋果植株葉片，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測，采用瓊脂糖凝膠電泳、反應(yīng)液加入2.0 μL 1 000×SYBR GreenⅠ觀察顏色變化分析判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP引物篩選

用3組引物分別對ACLSV陽性樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，每組引物設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果如圖1所示。Ⅲ組引物擴(kuò)增效果最好，出峰最早且曲線光滑；Ⅱ組引物在出峰時間和曲線的光滑度上都不及Ⅲ組引物；Ⅰ組引物沒有擴(kuò)增出“S”型曲線。所以采用Ⅲ引物作為ACLSV RT-LAMP的檢測引物。

2.2 RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1 最適Mg2+濃度 隨Mg2+濃度的增加RT-LAMP反應(yīng)出峰時間越早，當(dāng)Mg2+濃度到達(dá)6.0 mmol·L-1時，出峰時間最早且擴(kuò)增曲線較光滑，當(dāng)濃度超過6.0 mmol·L-1后，隨Mg2+增加反應(yīng)效果越來越差。故選擇6.0 mmol·L-1Mg2+作為ACLSV RT-LAMP檢測的最佳濃度（圖2）。

2.2.2 最適dNTPs濃度 隨著dNTPs濃度的增加，其反應(yīng)規(guī)律同Mg2+反應(yīng)規(guī)律，dNTPs濃度為1.2 mmol·L-1時擴(kuò)增曲線光滑出峰時間早，故1.2 mmol·L-1dNTPs為ACLSV RT-LAMP檢測最適反應(yīng)濃度（圖3）。

2.2.3 最適甜菜堿濃度 加入甜菜堿后擴(kuò)增效果明顯較好，甜菜堿濃度在0.2—0.8 mol·L-1時對RT-LAMP擴(kuò)增效果影響差異不大且效果好，所以綜合考慮成本因素，選擇0.2 mol·L-1甜菜堿為最適反應(yīng)濃度（圖4）。

紫色Purple：Ⅰ組引物擴(kuò)增曲線Amplification curves of group I primers；紅色Red：Ⅱ組引物擴(kuò)增曲線Amplification curves of group Ⅱ primers；黃色Yellow：Ⅲ引物擴(kuò)增曲線Amplification curves of group Ⅲ primers

1: 2.0 mmol·L-1; 2: 4.0 mmol·L-1; 3: 6.0 mmol·L-1; 4: 8.0 mmol·L-1; 5: 10.0 mmol·L-1; 6: 12.0 mmol·L-1

2.2.4 最適FIP/BIP濃度 當(dāng)FIP/BIP濃度為1.6—2.0 μmol·L-1時反應(yīng)，出峰時間早且曲線光滑，當(dāng)FIP/BIP濃度高于或低于這個范圍時，出峰時間均較晚且曲線不夠光滑，故選擇1.6 μmol·L-1為FIP/BIP最適反應(yīng)溫度（圖5）。

2.2.5 最適F3/B3濃度 當(dāng)F3/B3濃度為0.2 μmol·L-1時，出峰時間最早且曲線光，當(dāng)F3/B3濃度高于或低于0.2 μmol·L-1，出峰時間均較晚，且曲線不夠光滑，所以選擇0.2 μmol·L-1為F3/B3最適反應(yīng)濃度（圖6）。

1: 0.6 mmol·L-1; 2: 0.8 mmol·L-1; 3: 1.0 mmol·L-1; 4: 1.2 mmol·L-1; 5: 1.4 mmol·L-1; 6: 1.6 mmol·L-1; 7: 1.8 mmol·L-1

1: 0 mol·L-1; 2: 0.2 mol·L-1; 3: 0.4 mol·L-1; 4: 0.6 mol·L-1; 5: 0.8 mol·L-1; 6: 1.0 mol·L-1; 7: 1.2 mol·L-1

2.3 最適反應(yīng)條件

在所設(shè)置的4個不同反應(yīng)溫度下，65℃RT- LAMP反應(yīng)不能進(jìn)行，63、61℃出峰較晚，59℃時出峰時間最早，且曲線光滑，故選擇59℃為RT-LAMP最適反應(yīng)溫度；從在59℃下擴(kuò)增的兩條曲線來看，當(dāng)反應(yīng)時間到達(dá)60 min時，反應(yīng)的擴(kuò)增量已經(jīng)達(dá)到最大值，故選擇60 min為反應(yīng)最適時間（圖7）。

2.4 特異性檢測

以感染ASGV、ASPV、ApMV、ACLSV和健康植株葉片的RNA為模板，以無菌水為空白對照進(jìn)行RT-LAMP特異性檢測。RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，僅ACLSV陽性樣品呈現(xiàn)特征性梯狀條帶，其他樣品均未見特征性擴(kuò)增條帶（圖8-A）；各管中加入2.0 μL 1 000×SYBR GreenⅠ后，僅有ACLSV陽性樣品反應(yīng)液顏色變綠，其他各管均為橙色（圖8-B）；實時熒光定量PCR儀觀測結(jié)果同樣，ACLSV陽性樣品擴(kuò)增曲線為光滑的“S”型，其他3個病毒陽性樣品未形成“S”型曲線（圖8-C）。

1: 0.8 μmol·L-1; 2: 1.2 μmol·L-1; 3: 1.6 μmol·L-1; 4: 2.0 μmol·L-1; 5: 2.4 μmol·L-1

1: 0 μmol·L-1; 2: 0.1 μmol·L-1; 3: 0.2 μmol·L-1; 4: 0.3 μmol·L-1; 5: 0.4 μmol·L-1

黃色Yellow：65℃；紫色Purple：63℃；藍(lán)色Blue：61℃；粉色Pink：59℃；紅色Red：57℃

2.5 RT-PCR和RT-LAMP靈敏性檢測

將ACLSV陽性樣品總核酸進(jìn)行10倍梯度濃度稀釋至10-6，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)。各管中加入2.0 μL 1 000×SYBR GreenⅠ結(jié)果顯示總核酸稀釋至10-3時，RT-LAMP仍能檢測出ACLSV（圖9-A、9-B），RT-PCR檢測ACLSV的總核酸最大稀釋倍數(shù)為10-1（圖9-C），表明RT-LAMP檢測ACLSV的靈敏度是RT-PCR的100倍。

2.6 田間疑似病株檢測

將田間隨機(jī)采集的23個ACLSV疑似感染植株，進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP檢測。結(jié)果23個疑似感染植株RT-LAMP檢測出15個陽性樣品（圖10-A、10-B），檢出率為65.2%；RT-PCR檢測出12個陽性樣品（圖10-C），檢出率為52.2%。RT-LAMP檢測出ACLSV陽性樣品多于RT-PCR，表明RT-LAMP較高的靈敏性。

3 討論

在RT-LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗中筆者采用了實時熒光定量PCR儀對結(jié)果進(jìn)行了實時觀測，保證了試驗結(jié)果更為精確和客觀，同時也可避免RT-LAMP產(chǎn)物對實驗室造成污染的威脅。實時熒光定量PCR儀在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，反應(yīng)體系中熒光顯色物質(zhì)的參與，使得擴(kuò)增過程中的熒光強度和產(chǎn)物之間建立對應(yīng)的線性關(guān)系，最終通過電腦分析收集的信號形成擴(kuò)增曲線。理想狀態(tài)下擴(kuò)增曲線符合2N方程（N為循環(huán)次數(shù)），線型應(yīng)為“J”型，但本研究中擴(kuò)增曲線通常表現(xiàn)為“S”型。在PCR擴(kuò)增曲線初期信號的背景值與產(chǎn)生的熒光值不能明顯區(qū)分，熒光信號隨著PCR的產(chǎn)物擴(kuò)增進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期后，PCR產(chǎn)物的量就可以在指數(shù)期的線型上被檢測出來[28]。本試驗正是利用了這一原理，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，實時監(jiān)測擴(kuò)增過程，后通過擴(kuò)增曲線確定反應(yīng)的擴(kuò)增效果。

A：電泳檢測Detection by electrophoresis；B：肉眼觀察加入SYBR GreenⅠ后反應(yīng)液顏色變化Observation of the color change of the reaction liquid after adding SYBR Green I；C：實時熒光定量擴(kuò)增曲線判斷The judgement curves of real-time amplification。1：ACLSV；2：ApMV；3：ASGV；4：ASPV；5：清水對照Water control

A：肉眼觀察加入SYBR GreenⅠ后RT-LAMP 反應(yīng)液顏色變化Observation of the color change of the RT-LAMP reaction liquid after adding SYBR Green I；B：RT-LAMP電泳檢測Electrophoresis detection of RT-LAMP；C：RT-PCR電泳檢測Electrophoresis detection of RT-PCR。M：2000 bp DNA marker；1—7：RNA原液100—10-6稀釋液100-10-6diluents of original RNA；8：清水對照Water control

A：RT-LAMP產(chǎn)物加入SYBR GreenⅠ SYBR Green Ⅰdye result of RT-LAMP product；B：RT-LAMP產(chǎn)物電泳檢測electrophoresis detection of RT-LAMP product；C：RT-PCR電泳檢測electrophoresis detection of RT-PCR product。M：2000 bp DNA marker；1—23：待測樣品Samples；24：清水對照Water control

引物在整個反應(yīng)中起著重要的作用，不同引物其退火溫度及引物間序列堿基大小的不同，直接影響RT-LAMP反應(yīng)中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成[29]，從而影響RT-LAMP反應(yīng)。本試驗依據(jù)RT-LAMP反應(yīng)原理，在18條已報道的ACLSV基因組保守區(qū)域設(shè)計了3組引物。3組引物設(shè)計過程中，在滿足反應(yīng)原理的基礎(chǔ)上，盡量將引物位置定位在保守區(qū)域，再通過試驗驗證引物的可用性。由圖1可得出的第3組引物效果最好，原因應(yīng)該是該組引物與ACLSV基因組匹配度更高，其余兩組引物可能是不符合RT-LAMP的反應(yīng)要求。

本試驗對RT-LAMP反應(yīng)體系，即Mg2+、dNTPs、Betaine、FIP/BIP、F3/B3濃度，反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度均進(jìn)行了優(yōu)化，確保了反應(yīng)在最佳的條件下進(jìn)行，節(jié)省了材料和時間。對4種常見的蘋果病毒病原進(jìn)行了RT-LAMP特異性研究，結(jié)果表明RT-LAMP檢測ACLSV具有很高的特異性。2016年，盧永燦[30]針對梨寄主建立了ACLSV RT-LAMP檢測方法。本研究針對蘋果寄主，進(jìn)一步完善了用RT-LAMP法檢測不同寄主感染ACLSV的情況，而且通過實時熒光定量PCR儀進(jìn)行實時監(jiān)測，試驗結(jié)果更精確更具有說服力。

高效靈敏是LAMP反應(yīng)的一大優(yōu)點，本研究表明RT-LAMP的確具有很高的特異性，RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍。周彤等[21]利用RT-LAMP方法檢測水稻黑條矮縮病毒（，RBSDV），結(jié)果表明RT-LAMP檢測方法可特異地檢測植物和飛虱體內(nèi)的RBSDV，與RT-PCR靈敏度基本一致；劉科宏等[24]研究表明，RT-LAMP方法檢測柑橘黃化脈明病毒（）靈敏度是RT-PCR方法的10倍；王永江等[31]研究表明，RT-LAMP方法檢測柑橘衰退病毒（，CTV）靈敏度是RT-PCR的100倍；Ju[32]利用RT-LAMP技術(shù)檢測馬鈴薯卷葉病毒（）的靈敏度是RT-PCR技術(shù)的2000倍；姜珊珊等[33]研究表明，RT-LAMP檢測甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）靈敏度是RT-PCR的10倍。由此可見，不同的RT-LAMP反應(yīng)中，RT-LAMP的靈敏度差異較大，原因可能是在不同的反應(yīng)中設(shè)計的引物長度、引物間距離、引物溶解溫度、引物末端穩(wěn)定性、GC含量與二級結(jié)構(gòu)不同，引物和模板的結(jié)合率受到了不同的影響，也可能與反應(yīng)中酶活性、化學(xué)試劑、人為操作有關(guān)。

目前世界上報道的蘋果病毒有39種之多[1]，培育無毒苗木以及開展蘋果病毒種類調(diào)查均需要對病毒進(jìn)行檢測。RT-LAMP作為一種敏感、特異、簡便、快速的新型檢測技術(shù)，具有一定的優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域。本研究建立的RT-LAMP檢測方法，無需專門的儀器，直接以待測樣品RNA為模板，一步反應(yīng)即可完成檢測，反應(yīng)僅需1 h，更適合基層單位對大量樣品進(jìn)行ACLSV檢測。

4 結(jié)論

成功建立了蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）RT- LAMP檢測方法，該方法具有較好的特異性、靈敏性，可以快速地通過肉眼觀察試驗結(jié)果，適合基層單位大量檢測ACLSV。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Establishment of RT-LAMP Assay for Detection of(ACLSV)

ZHANG ShuangNa, LI ZhengNan, FAN XuDong, ZHANG ZunPing, REN Fang, HU GuoJun, DONG YaFeng

(National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Tree, Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】The objective of this study is to establish a method which uses reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) technology, and to detect(ACLSV) simply and quickly. 【Method】Three sets of specific primers were designed based on conserved region of ACLSV genomes. Each set of primers includes a pair of outer primer (F3/B3) and a pair of inner primer (FIP/BIP). One feasible set of primers was selected for the RT-LAMP reaction. RT-LAMP reaction system was optimized, that is, the concentration of Mg2+(0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 mmol·L-1), dNTPs (0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 mmol·L-1), Betaine (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mol·L-1), FIP/BIP (0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4 μmol·L-1) and F3/ B3 (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 μmol·L-1), respectively. The RT-LAMP reaction condition was optimized, using optimized reaction system, reaction temperature was set to 65, 63, 61, 59, 57℃ and reaction time was set for 90 min. In the process of primers screening and optimizing the reaction system, fluorescent pigment was addedto the reaction system and real-time PCR instrument was used. The whole process was detected in real-time by fluorescence signal accumulation. Finally, the amplification curve was used to analyze the reaction result. the specificity detection of RT-LAMP was tested by using different RNA templates of infected leaves from ACLSV,(ASGV),(ASPV) and(ApMV). To assess the detection sensitivity, 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6diluents of original RNA were used as templates of RT-LAMP. To evaluate the application value of this method, 23 apple leaf samples were collected randomly in the field, the optimized RT-LAMP and RT-PCR were used to detect the samples, SYBR GreenⅠwas added to visualize the detection. 【Result】 The RT-LAMP method to detect ACLSV was established. The optimized detection system was 6.0 mmol·L-1Mg2+, 1.2 mmol·L-1dNTPs, 0.2 mol·L-1Betaine, 1.6 μmol·L-1FIP/BIP and 0.2 μmol·L-1F3/B3 primer. The optimum reaction conditions were 59℃ and 60 min. In the specificity test, only the ACLSV test result was positive, the controls were all negative. In the sensitivity test, the 10-3RNA dilution could be detected by RT-LAMP method. It was 100 times higher sensitivity than RT-PCR method. The positive rate of RT-PCR of randomly selected 23 apple leaf samples was 52.2%, and RT-LAMP was 65.2%. Detection rate of RT-LAMP was higher than that of RT-PCR. 【Conclusion】The established ACLSV RT-LAMP detection method is simple, quick, sensitive and low cost. It can be applied in field investigation, seeding breeding and customs quarantine.

apple;(ACLSV); reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP); real-time PCR; virus detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.008

2017-09-26；

2017-11-27

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610182016017）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ZX75-2018）

張雙納，E-mail：zsnjer@163.com。

董雅鳳，E-mail：yfdong1234@163.com