禽用活疫苗外源病毒污染情況的調查研究

劉 丹，侯力丹 ，李啟紅，黃小潔，李俊平，楊承槐

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

獸用疫苗的安全性一直是企業、養殖戶和監管部門非常重視的問題。由于疫苗的生產原材料如組織、細胞、血清等大多來源于動物，因此疫苗產品存在外源病毒污染的風險[1-3]。污染了外源病毒的疫苗不僅不能預防和控制疾病，反而造成疾病爆發和擴散，對人和養殖業造成巨大危害，所以實施系統性的檢測和采取嚴格的預防措施可以有效降低外源病毒污染的風險。

近年來發生的禽用活毒疫苗污染事件，以禽白血病病毒(Avian leucosis virus，ALV)[4-5]、網狀內皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)[6-7]和雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CAV)[8-9]較為常見。如果禽用活疫苗混有ALV、REV和CAV等外源病毒，在使用污染的疫苗時會加劇該疫病的傳播，并且這些疾病可引起免疫抑制、免疫失敗或直接導致免疫動物發病，影響正常疫苗免疫效果[10]。

進行禽用活疫苗外源病毒污染的檢驗，對確保疫苗質量和產品安全方面具有重要作用。為對禽用活疫苗污染外源病毒的情況進行摸底調查，試驗抽取了18家國內生產企業、7家國外企業生產的禽用活疫苗重點品種，按照《中國獸藥典》 2010年版三部外源病毒檢驗[11]雞檢查法和《禽病活疫苗禽腺病毒污染摸底調查工作方案》對抽檢的禽病活疫苗進行了外源病毒污染和禽腺病毒(Group I adenovirus，FAdV-I)污染檢驗，為更好監控疫苗安全性提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 共抽檢禽用活疫苗8種28批(表1)。

表1 國內外企業抽檢的疫苗Tab 1 Vaccines of domestic and foreign enterprises

1.1.2 主要試劑 雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ReoV)、雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease virus，IBDV)、禽網狀內皮組織增生癥病毒、禽白血病病毒(A、B亞群和J亞群)、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus，AEV )、雞傳染性貧血病毒ELISA抗體檢測試劑盒均購自IDEXX公司；雞傳染性喉氣管炎病毒(Avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV)ELISA抗體檢測試劑盒、FAdV-I抗體檢測試劑盒為Biocheck公司產品；禽A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)(H5、H9亞型)、雞新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)的血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI )試驗抗原和陽性血清、FAdV-I和雞馬立克氏病病毒( Marek's disease virus，MDV)的瓊擴抗原和陽性血清、雞陰性血清均為中國獸醫藥品監察所病毒制品檢測室保存。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物準備 自山東斯帕法斯實驗動物技術有限公司購入25日齡SPF雞350只，隔離器中飼養備用。

1.2.2 首免 按照各批疫苗瓶簽注明的羽份，每批疫苗至少抽取2瓶，均用生理鹽水混合稀釋成100 羽份/ mL，各點眼接種31日齡SPF雞10只，每只0.1 mL(含10羽份)，同時肌肉注射接種1 mL(含100羽份)，隔離飼養觀察14 d。

1.2.3 二免 按首免方法和劑量重復接種1次。隔離飼養觀察21 d，記錄是否有因注射引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡情況。

1.2.4 分離血清 觀察到期，每只雞經翅靜脈采血1 mL，分離血清-20 ℃保存備用。

1.2.5 ELISA抗體檢測 進行IBV、REO、IBDV、REV、ALV(A、B亞群和J亞群)、AEV 、CAV、ILTV和FAdV-I等ELISA抗體檢測，依據各ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行。

1.2.6 瓊脂抗體檢測 FAdV-I和MDV抗體用瓊脂擴散試驗檢測，按常規方法進行。

1.2.7 HI檢測 AIV(H5、H9亞型)、NDV和EDSV抗體用HI試驗檢測，按常規方法進行。

2 檢驗結果

抽檢的18家國內生產企業、7家國外企業的共28批疫苗，接種SPF雞后，在35 d臨床觀察期內均健活；除了本疫苗所產生的特異性抗體外，其他外源病毒抗體檢測結果均為陰性；禽腺病毒抗體ELISA抗體和瓊脂擴散試驗檢測均為陰性，表明抽檢的疫苗均無外源病毒和禽腺病毒污染，結果見表2和表3。

表2 外源病毒檢驗結果(ELISA結果)Tab 2 The results of extraneous virus test(ELISA)

續表

雞病毒性關節炎活疫苗(S1133株)國外企業310/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性

表3 外源病毒檢驗結果(臨床觀察、HI和AGP結果) Tab 3 The results of extraneous virus test(Clinical observations, HI, and AGP)

雞傳染性法氏囊病復合凍干活疫苗(2512株)國外企業310/10健活10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性10/10陰性

續表

3 討 論

疫苗的預防接種是目前有效控制家禽疫病的重要手段之一，但由于病毒類制品在毒種選育和生產過程中經常使用動物或細胞培養，因此有可能造成外源病毒的污染。常見的外源病毒污染有REV、ALV和CAV等，這些病毒的共同特點是：既可以水平傳播，也可以垂直傳播，感染后能引起免疫抑制，沒有相應的疫苗防控。 因此，一旦雞群感染這些病原，將會引起嚴重的經濟損失[12]。為了保證產品質量，需要對毒種、細胞和成品進行外源病毒的檢測，我國常用的外源病毒檢驗方法有雞胚檢查法、細胞檢查法和雞檢查法。雞檢查法一般不用，只在用雞胚檢查法進行外源病毒檢驗無結果或可疑時，用雞進行檢驗[11-13]。

除了上述常見的外源病毒污染外，近年來I群禽腺病毒(FAdV-1)疫情爆發，受到農業部高度重視，農業部獸醫局下發了《關于開展禽病活疫苗腺病毒污染摸底調查的函》(農醫藥便[2016]87號)，中監所組織相關技術專家制定了禽腺病毒摸底調查方案。我們查閱比較了國內外有關禽病活疫苗禽腺病毒污染控制的方法，發現我國、美國及歐洲對禽病活疫苗成品進行外源病毒檢驗時均無專門針對I群FAdV檢驗的方法，《歐洲藥典》對基礎種毒的外源病毒檢驗需用雞檢查法，該方法規定需對I群FAdV進行檢測。而我國對基礎種毒外源病毒的檢驗未強制使用雞檢查法，且我國目前的雞檢查法中也沒有對I群FAdV檢測的要求。

《禽病活疫苗禽腺病毒污染摸底調查工作方案》中的檢驗方法，是借鑒《歐洲藥典》2.6.24"6.Test For Extraneous Agents Using Chicks"。即：取2～5周齡的SPF雞10只，點眼接種10羽份疫苗，肌肉注射100羽份疫苗，2周后，按上述方法和劑量重復接種1次。接種后每天觀察SPF雞狀態。第2次接種后21日采血，用瓊脂擴散試驗方法、ELISA方法或間接免疫熒光方法檢測I群FAdV抗體。在接到農業部獸醫局開展禽病活疫苗腺病毒污染摸底調查的任務后，制定方案、抽檢疫苗、進行禽腺病毒污染檢驗，同時對所有的疫苗進行了其他外源病毒抗體的檢測。試驗用的試驗動物數量和免疫程序，雖與《中國獸藥典》2010年版三部雞檢查法不一致，但由于該方法與《歐洲藥典》雞檢查法一致，所以試驗的外源病毒檢測結果是有效和具有說服力的[14]。

試驗抽取了18家國內生產企業、7家國外企業生產的禽用活疫苗重點品種，結果顯示所抽檢的禽用活疫苗均無外源病毒污染和禽腺病毒污染，表明我國禽用活疫苗的質量控制和安全性良好，這是企業、養殖戶和監管部門共同努力的結果。為了保證生物制品安全，所有起始材料和最終產品都必須檢測潛在污染物。盡管如此，污染風險還不能完全排除，只是盡可能降低。對于新發現的風險因子并沒有具體規定和檢測方法，應該采取什么措施才能最大程度地提高安全性值得考慮[15]。對于I群FAdV，中國獸醫藥品監察所病毒制品檢測室也正在建立其污染禽用活疫苗的相關檢驗方法，以期納入新版獸藥典，規范禽病毒類生物制品外源病毒檢驗。

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